物镜数值孔径（NA）值的算法

在显微镜的各种部件中，物镜是显微镜很重要的一个部件，其数值孔径的大小关乎着显微镜观察标本的清晰度，也就是说，数值孔径越大，清晰度也就越高。那么数值孔径是咋样算出来的呢？油镜水镜又是咋的一回事呢？

显微镜物镜捕捉偏离光线从标本的能力取决于数值孔径和介质通过其中的光。

数值孔径通过以下等式与成像介质相关：

其中，μ是物镜孔径角的一半，n是物镜前透镜和样本盖玻片之间介质的折射率。

从上述数值孔径方程中可以明显看出，物镜的数值孔径与盖玻片和前透镜之间的成像介质的折射率（n）成正比，并且还与物镜的角孔径的一半的sin成正比。由于sinµ不能大于90度，因此最大可能的数值孔径由浸没介质的折射率决定。大多数显微镜物镜使用空气作为介质，光线必须通过保护样品的盖玻片和物镜的前透镜之间。这种类型的物镜被称为干物镜，因为它们在没有液体成像介质的情况下使用。空气的折射率为1.0003，非常接近真空，比大多数液体低得多，包括水（n= 1.33），甘油（n= 1.470）和常见的显微镜浸没油（平均n= 1.515）。在实践中，干物镜系统的最大数值孔径被限制为0.95，并且更大的值只能使用为浸没介质设计的光学器件来实现。

油浸的原理如图1所示，其中单个光线通过样品追踪，并进入物镜或在其他方向折射。 图1（a）示出了具有五条射线（标记为1至5）的干物镜的情况，所述五条射线示出为穿过覆盖有盖玻片的样品。 这些光线在盖玻片-空气界面处被折射，只有最靠近显微镜光轴的两条光线（光线1和2）具有适当的角度进入物镜前透镜。 第三条光线以大约30度的角度折射到盖玻片上，并且不进入物镜。 最后两条射线（4和5）通过盖玻片被内反射回来，并且沿着第三条射线，在玻璃表面处促成光的内反射，这倾向于降低图像分辨率。 如图1（B）所示，当空气被折射率与玻璃相同的油所取代时，光线将直接穿过玻璃-油界面，而不会因折射而发生偏离。因此，数值孔径增加了n倍，n是油的折射率。这个现象可以通过交互式Java教程《沉浸油和数值孔径》来探索。

显微镜物镜设计用于浸油有许多优点比那些使用干。浸没物镜通常具有更高的校正（萤石或复消色差），当使用具有适当色散和粘度的浸没油时，其工作数值孔径可达1.40。这些物镜允许子级聚光器光阑被打开到更大的程度，从而延长了样品的照明，并利用增加的数值孔径。

当使用增加数值孔径的油浸物镜时，通常忽略的一个因素是载物台聚光镜对系统的限制。在NA= 1.40的油物镜被用于对具有较小数值孔径（例如1.0）的载物台下聚光器的样本进行成像的情况下，聚光器的较低数值孔径覆盖物镜的数值孔径，并且系统的总NA被限制为1.0，即聚光器的数值孔径。

现代的载物台聚光器通常具有高度的校正（参见我们关于聚光器的部分），数值孔径值在1.0和1.40之间。 为了有效地利用油浸的所有优点，载物台聚光器前透镜和包含样品的显微镜载玻片底面之间的界面也应浸入油中。 图2示意性地示出了一个理想的系统，其中浸没油被放置在物镜前透镜和样品载玻片之间的界面处，以及聚光器的前透镜和样品载玻片的下侧之间。

该系统被称为均质浸没系统，它是在光学显微镜中实现最大数值孔径和分辨率的理想情况。在这种情况下，物镜前透镜、浸油、子台聚光器前透镜和安装介质的折射率和色散相等或非常接近相等。在这个理想的系统中，倾斜的光线可以通过聚光透镜，并完全通过显微镜载玻片，浸渍油，并安装介质不偏离在油—玻璃或安装介质—玻璃界面的折射。

当使用高倍率消色差油浸物镜时，有时允许省略聚光镜顶部透镜的抛光步骤。 这是因为聚光镜孔径光阑必须经常减少较少校正的物镜，以消除伪影并提供最佳成像。 光阑尺寸的减小减小了数值孔径（由放大聚光透镜提供）的潜在增加，因此在这些条件下图像质量的损失通常可以忽略不计。

有多种市售的合成油被设计用于优化浸没显微镜技术。许多国家已经发布了他们自己的浸渍油必要质量的标准，国际标准化组织已经认可了通用浸渍油的ISO 8036标准光学性能：

• n _e =1.5180±0.0005(n _D =1.515)

• V_e= 44 ± 3（阿贝数-色散的度量）

• 温度= 23 ± 0.1摄氏度

除了严格控制光学性能外，浸渍油还必须具有合适的物理化学特性，例如不干燥、对光学表面涂层呈惰性、不发荧光、化学惰性、无毒和易于去除。 大多数显微镜制造商都为他们的物镜提供专门的浸没油，该油与物镜的色散特性特别匹配。 确保您购买的任何售后机油符合与机油预期目标相匹配的分散标准。一些较老的商业生产的浸渍油（特别是那些10多年前生产的）含有大量的多氯联苯。 这些油是致癌的，应该避免，但大多数新的浸渍油没有这种危险的化学品，是完全安全的使用。 浸渍介质的主要制造商是卡吉尔实验室公司，的Cedar格罗夫，新泽西制造五种标准类型的油：

• 普通光学显微镜-最常见的浸渍油满足两种粘度要求（A型和B型）：150和1250厘沲。这些油可以混合以产生中间粘度。

• 高粘度油（NVH型）-粘度为21，000厘沲，适用于倒置、水平和倾斜应用，也适用于工作距离很长的物镜和使用宽聚光镜间隙的样品。

• 荧光显微镜（DF型）-一种油，产生最高的分辨率与荧光显微镜。这种油产生的背景颜色是淡绿色。

• 荧光显微镜（FF型）-改进的油，基本上没有背景荧光，是水晶般透明和非吸湿性。这种油通常被称为“通用”油，因为它可以取代几乎任何其他荧光应用的浸渍油。

表1列出了三种最常见的卡吉尔实验室浸渍油的特性。

普通浸渍油的主要问题是它们在光谱的紫外区域（低于约375纳米）中固有的高吸收特性。 这并不影响大多数使用浸没介质进行的可见光光学显微镜检查，但当试图以低于400纳米的波长对样品进行成像时，它可能会导致麻烦。 甘油的紫外吸收在400-350纳米范围内可以忽略不计，因此纯溶剂或与水的90：10混合物可以用于近紫外显微镜的浸没技术。

红外（IR）显微镜也是复杂的文物所产生的吸收浸没材料在波长超过700纳米。红外显微镜唯一实用的介质是石蜡油，它也适用于荧光浸没显微镜，因为它在波长低至350纳米时具有可忽略的荧光。

表2中列出的浸没介质具有宽范围的折射率，可用于各种不同的光学显微镜技术。 大多数折射率等于或低于玻璃的介质用于普通生物明场、相衬、DIC和荧光显微镜。 这些介质具有非常高的折射率，如溴萘和碘甲烷，与专门的物镜一起使用，以实现最高的数值孔径和分辨率，并且在反射光显微镜中对于具有非常低或变化的反射率的材料也非常有用。

组织和细胞培养技术的现代进步激发了人们对能够对浸泡在生理盐水溶液中的活细胞和组织进行成像的兴趣。 活组织内的细胞动力学目前正在大量研究定量光学成像技术，包括共聚焦，微分干涉对比（DIC），和落射荧光显微镜。 活细胞的平均折射率为1.35，非常接近于必须存在以支持正在进行的细胞活动的周围缓冲盐水溶液（n = 1.33）的折射率。当使用长工作距离的干物镜来观察含水组织培养物中的细胞时，由于来自液体表面的反射会模糊标本的细节，因此会出现问题。同样，由于水性成像介质和物镜前透镜的玻璃之间的折射率差异，使用油浸物镜观察活细胞也是有问题的。

图3所示的物镜设计用于在缓冲盐水溶液中对细胞和组织进行成像，同时在观察期间为样品的显微操作提供足够的空间。 容纳物镜的前透镜元件的鼻状部（或浸入锥）以43度角逐渐变细，以允许通过操纵器或微电极容易地接近样品，同时保持样品和物镜浸入溶液中。 这些物镜还具有从2.0 mm（60 x Plan Fluorite）到3.3 mm（10 x-40 x Plan Fluorite）的长工作距离，这也有助于为样品的显微操作提供额外的空间。 这一系列物镜的数值孔径与典型的干PlanFluorites中的数值孔径相当（通常略高）。这种类型的物镜由包括Olympus、Zeiss、Leica和Nikon在内的所有主要显微镜公司制造，并且制造商通常提供用于组织培养样品和其他生物样品的显微操作的附加附件。

图4通过观察组织培养中的活体大鼠提睾肌，很好地证明了水浸物镜的分辨率和细节增强。

图4（a）是用定位在空气/水界面正上方的正常干燥4x物镜拍摄的大鼠组织的显微照片。 请注意由于水面的反射而发生的样本的失真和模糊。图4（B）中消除了这些影响，这是相同视场的显微照片，但使用了4倍水浸物镜。 这种图像比干物镜清晰得多，显示的细节分辨率也更高。

组织样本成像的另一个问题是当在高放大率下检查样本时，油浸物镜所表现出的分辨率和照明强度的有限范围。 浸入式物镜通常在样品中超过10微米的深度处失去其优异的成像特性，此时样品被盖玻片覆盖并浸泡在水溶液中。 这个问题在图5（a）中示出，其中射线追踪表明，当使用油浸物镜通过n = 1.515的浸油对样品成像时，水性介质中的球体被扭曲成明显伸长的椭圆形。

当使用水浸物镜时，相同的球体保持球形，即使成像射线仍然必须通过折射率等于1.515的玻璃盖玻片。 水浸物镜还消除了球面像差，球面像差通常是通过水溶液观察标本时产生的。 这些先进的物镜还具有更高的轴向分辨率，通常等于数值孔径的理论极限，并且它们产生出色的对比度和分辨率，并提供更高的照明强度。

显微镜的第一条规则是保持光学元件完全没有灰尘，污垢，油，溶剂和任何其他污染物。 显微镜应保存在低振动、无烟、尽可能清洁且对循环空气干扰最小的房间内。不使用时，在显微镜上使用防尘罩，并将所有附件保存在密封容器中。 避免使用腐蚀性溶剂清洁显微镜的任何部分，仅使用稀释的肥皂水清洁非光学表面。使用润滑油时应牢记以下技术和注意事项：

• 第一步是用低倍物镜定位样品，并放置显微镜载玻片，使感兴趣的区域正好位于载物台开口的中心部分。 通常需要将浸没物镜（无油）旋转到位，以确保样品的正确位置。 为了达到最佳效果，当使用油浸技术时，重要的是还将油涂在显微镜载玻片的下侧和载物台聚光镜的顶部透镜上，以在两者之间形成油珠，如下所述。 大多数现代显微镜在机械载物台中提供相对宽的椭圆形开口，以允许油用于显微镜载玻片的底部和聚光器的前透镜之间的区域。

• 将浸没物镜旋转到鼻架中的一个位置，在该位置处，它将是旋转到样品正上方的光路中的下一个物镜。使用一张不起毛的纸或滴管将一小滴油直接滴在浸没物镜的前透镜上。接下来，将另一滴油滴放在盖玻片上，紧靠要成像的区域上方。Olympus和Nikon制造的许多较新的油浸物镜在其油浸物镜中使用平凹前透镜，并且对于这些物镜，必须不省略物镜前透镜的抛光步骤。如果不填充这些物镜中的凹“腔”，可能会导致微小气泡的截留，从而导致严重的耀斑和图像退化。

• 使用粗调焦调节旋钮将油物镜缓慢降低到显微镜盖玻片上的小油池中。当被油覆盖的物镜前透镜与盖玻片上的油接触时，在油交界处会发出一小束散射光，表明两个油池已经合并。这一步要非常小心，因为将物镜推得太靠近盖玻片会导致两者之间的碰撞，可能导致损坏。

• 使用粗调使样品慢慢聚焦，直到细节开始变得可见，然后切换到微调使样品正确聚焦。 重要的是要记住，大多数萤石物镜和复消色差物镜的工作距离小于十分之一毫米，导致细调焦旋钮的调整范围非常窄，因此在粗调或微调时，请仔细监控物镜接近油池的情况。 虽然大多数高功率油浸物镜具有弹簧加载的前端，可以缩回到物镜的主体中，但是不小心使用这些物镜仍然可以将物镜驱动到样品载玻片中，从而造成损坏。

• 许多显微镜使用的另一种方法是使用低倍率物镜将待成像区域定位在显微镜光路的中心。 接下来，将油浸物镜（无油）放入光路中，并将感兴趣的样本区域大致带入视场中心并聚焦。这将预先定位系统的所有部件，为添加机油做好准备。 将浸没物镜旋转到显微镜镜鼻架上的相邻挡块处，并如上所述在物镜前透镜和样品上涂抹油。 接下来，快速旋转上油的物镜到样品上方的位置，将两个油滴（一个在样品上，一个在物镜上）合并到一个池中。标本现在可以进行观察和显微照相了。

为给载物台聚光镜的前透镜加油，请注意以下事项：

• 确保显微镜的机械载物台具有足够大的开口，以允许扫描涂油样本，而不会将油溢出到载物台底部。许多先进的研究显微镜有一个阶段插入，是可移动的使用油。在聚光镜顶部透镜上涂油之前，从显微镜载物台上取下载玻片。

• 以类似于物镜的方式，将一滴油滴在显微镜载玻片的底部，并将类似的油滴应用于载物台聚光镜的前透镜。 在将显微镜载玻片放回载物台之前，确保聚光镜在其支架中略微降低。 将载玻片放在载物台上后，将聚光镜放回正确位置，同时仔细观察聚光镜透镜和显微镜载玻片上的油滴。 当冷凝器进入适当的位置时，这些液滴应该合并成一个。

• 在扫描涂油的显微镜载玻片表面时，定期观察载物台相对于物镜和聚光镜前透镜的位置，以确保这些元件和显微镜载玻片之间有连续的油珠。当在显微镜载玻片上扫描大面积时，通常需要重新涂抹一些油以确保成像介质的连续性。

以上就是数值孔径NA值的计算方法，还有油镜和水镜的数值孔径中间的关联关系，欢迎一起探讨哦13817705659