物镜在直射光下的图像抓取

标本的观察步骤，首先是从物镜抓取图像，再通过显微镜管鼻传到目镜里面的，那么物镜是咋样抓取图像呢？原理是这样的：

在光学显微镜中，当显微镜灯发出的光通过聚光镜，然后通过样品（假设样品是吸光样品）时，一部分光在其路径上不受干扰地绕过和穿过样品。这种光称为直射光或无偏光。 环绕样品的背景光（通常称为环绕光）也是无偏光。另一方面，一些穿过样品的光在遇到样品的部分时发生偏离。

这种偏离的光（如你随后将学习的，称为衍射光）被渲染为半波长或180度的步骤（更常见的是，相位）与直接光，已经通过未偏离。 由样品本身引起的半波长相位差使该光能够在两者到达目镜光阑处的中间像平面时与直射光产生相消干涉。 目镜的目镜透镜进一步放大这个图像，最后投射到视网膜或照相机胶片上。

所发生的是，直接或未偏离的光由物镜投射，并在目镜的光阑处均匀地分布在整个像平面上。 由样品衍射的光被带到聚焦在同一图像平面上的各个局部位置，如图2所示;并且衍射光在那里引起相消干涉，并降低强度，从而导致或多或少的暗区。 这些明暗的图案就是我们所认识的标本的图像。由于我们的眼睛对亮度的变化很敏感，因此图像或多或少成为原始样本的忠实重建。

为了帮助您理解基本原理，建议您尝试以下练习，并使用已知结构的对象作为“样本”，例如载物台千分尺或类似的密集黑线光栅。 要继续进行，将精细的光栅放在显微镜载物台上，首先使用10倍物镜，然后使用40倍物镜将其聚焦。 取下目镜，在它的位置插入一个相位望远镜，这样你就可以聚焦在物镜的后焦平面上。 如果你把聚光镜的光圈关闭到最大，你会看到一个明亮的白色中心光点，这是光圈的图像。 在中心光斑的左右两侧，您将看到一系列光谱，每个光谱在最靠近中心光斑的部分上显示为蓝色，在距离中心光斑最远的光谱部分上显示为红色（如图3所示）。 这些彩色光谱的强度根据光谱离中心点的距离而降低。

靠近物镜边缘的光谱比靠近中心点的光谱暗。 这在图3中使用三种不同的放大率来说明。在图3（B）中，10倍物镜后焦平面处的衍射图案显示了两个衍射光谱。 如果你从载物台上取下光栅，如图3（a）所示，这些光谱消失了，只剩下孔径光阑的中心图像。如果你把光栅放回去，光谱就会重现。 请注意，彩色光谱之间的空间看起来很暗。如果你用10倍物镜检查光栅，你会发现只有一对光谱可以看到，一个在中心点的左边，一个在右边。 如果你用60倍物镜检查线光栅（如图3（d）所示，假设它的数值孔径比你的40倍高），你将观察到比你用40倍物镜（图3（c））所能看到的更多的光谱。

由于彩色光谱消失时，光栅被删除，它可以被认为是标本本身的影响，通过的光，从而产生的彩色光谱。 此外，如果你关闭孔径光阑，你会观察到，较高数值孔径的物镜比较低数值孔径的物镜“抓住”更多的这些彩色光谱。 这两个陈述对于理解图像形成的至关重要性将在下面的段落中变得清楚。

中心光斑（聚光器孔径光阑的图像）代表直接或未偏离的光穿过样品或样品周围不受干扰（如图4（b）所示）。 它被称为0阶或零阶。 孔径光阑在零阶两侧的较暗颜色的图像分别称为第一、第二、第三、第四等阶，如图4（a）中的模拟衍射图案所示，该图案将在40倍物镜的后焦平面处观察到。 在这种情况下，所有"捕获"级表示在物镜的后焦平面处看到的线光栅的衍射图案。

孔径光阑上较暗的衍射图像是由光线在线光栅的每个开口处偏离或衍射而成的，呈扇形展开（图4（b））。蓝色波长以比绿色波长小的角度衍射，绿色波长以比红色波长小的角度衍射。

在物镜的后焦平面，来自每个狭缝的蓝色波长相长干涉，以产生每个光谱或阶的衍射图像的蓝色区域;红色和绿色区域也是如此（图4（a））。 当这些颜色的衍射波长相差1/2波时，波相消干涉。因此，光谱或阶之间存在暗区。 在零阶位置，来自每个狭缝的所有波长相长地相加;这产生了明亮的白色光，您可以在物镜后焦平面的中心看到零阶光（图3和图4）。

如图5所示，线光栅的间距越近，由给定物镜“捕获”的光谱就越少。 图5（a）中所示的衍射图案是通过对图5（b）中的线光栅的下部成像的40倍物镜捕获的，其中狭缝更靠近在一起。 在图5（c）中，物镜聚焦在线光栅的上部（图5（b）），并且更多的光谱被物镜捕获。 直接光和来自衍射级的光继续前进，被物镜聚焦到目镜光阑处的中间像平面。 在这里，直射光和衍射光发生干涉，并因此被重建成真实的、被目镜的眼睛透镜“看到”的反转图像，并被进一步放大。 这在图6中用两种类型的衍射光栅示出。 图6（a）中所示的正方形网格表示通过物镜的全孔径看到的网格的无畸变图像（即通常的样品图像），而从该网格导出的衍射图案显示为在物镜的后焦平面处看到的锥光图像。 同样，六边形排列的网格的无畸变像（图6（c））产生了相应的一阶衍射图案的六边形排列的锥光像（图6（d））。

显微镜样品可以被认为是复杂的光栅，具有各种尺寸的细节和开口。 这种成像的概念主要是由世纪德国著名的显微镜学家和光学理论家恩斯特·阿贝发展起来的。 根据阿贝（他的理论在目前被广泛接受），如果物镜“捕获”了光的第0阶和至少第1阶，或者任何两个阶，样品的细节将得到解决。 获得物镜导纳的衍射阶数越大，图像就越准确地表示原始物体。

此外，如果在物镜的前透镜和盖玻片顶部之间的空间中使用折射率比空气高的介质（例如浸没油）（如图7（a）所示），则衍射级的角度减小，衍射光的扇形被压缩。因此，油浸物镜可以“捕获”更多的衍射级，并产生比干物镜更好的分辨率（图7（B））。

此外，由于蓝光以比绿色光或红光更小的角度衍射，所以当光是蓝光时，给定孔径的透镜可以捕获更多阶的光。这两个原则解释了经典的瑞利方程经常引用的分辨率：

其中d是两个相邻粒子之间的空间（仍然允许粒子被感知为分离的），λ是波长，NA是物镜的数值孔径。

进入物镜的较高衍射级的数量越多，可以清楚分离（分辨）的样品细节就越小。因此，这种标本的高数值孔径的价值。同样，可见光的波长越短，分辨率越好。这些想法解释了为什么高数值孔径复消色差透镜可以分离蓝光中的极小细节。

如果你在物镜的后面放置一个不透明的掩模来阻挡最外面的衍射级，你可以降低光栅线的分辨率，或者任何其他详细的物体，或者完全“破坏”分辨率，这样样品就看不见了。因此，通常的警告是不要关闭聚光镜孔径光阑低于建议的物镜孔径的2/3-4/5。

如果物镜未能"抓住"任何衍射级，就会产生无法分辨的图像（如图8（a）所示）。 因为，在一个非常微小的细节标本，衍射风扇是在一个非常大的角度传播，需要一个高数值孔径物镜来“捕捉”他们。 同样，由于衍射扇在油浸或水中被压缩，因此设计用于这种用途的物镜可以比干物镜提供给予更好的分辨率。从不同分辨率的物镜获得的衍射图样如图8所示。 图8中左边的图像没有分辨率，因为物镜没有捕获更高的衍射级。 图8（B）和（c）中的图案显示衍射级的数量增加，表明随着物镜捕获更多的级，样品的分辨率更好。

如果交替的衍射级被阻挡（仍然假设光栅作为我们的样本），光栅中的线的数量将出现加倍（一个虚假的分辨率）。重要的警告是，在物镜的后孔径处引入的动作可能对最终产生的图像产生重大影响。

对于样品中的小细节（而不是光栅），物镜将直接和衍射光投射到目镜光阑的像平面上，形成小的圆形衍射盘，称为艾里盘（如图9所示）。 高数值孔径物镜"捕获"更多的衍射级，并产生比低数值孔径物镜更小尺寸的光盘。在图9中，艾里盘大小从图9（a）到图9（c）稳定地减小。 图9（a）和（B）中较大的圆盘尺寸是由数值孔径较低的物镜产生的，而图9（c）中非常尖锐的艾里圆盘是由数值孔径非常高的物镜产生的。

在目镜光圈水平上得到的图像实际上是一个艾里盘的马赛克，你可以感觉到它的亮和暗。如果两个圆盘靠得太近，以至于它们的中心黑点相当大地重叠，则由这些重叠圆盘表示的两个细节不能分辨或分离，因此看起来像一个（如图10（a）所示）。

基本原理是直接光和衍射光的组合（或直接光或衍射光的操纵）在成像中至关重要。 这种操作的关键位置是物镜的后焦面和台下聚光镜的前焦面。 这一原理是光学显微镜中大多数对比度改进方法的基础;它在高放大率下对尺寸接近光波长的小细节特别重要。 阿贝是发展这些概念的先驱，以解释吸收或所谓的振幅样品的图像形成。 20世纪30年代，F.荷兰物理学家泽尔尼克在设计和解释相位显微镜时扩展了这些原理。