咋样以标本选择显微镜的照明方式（显微镜解决方案），为了更好使用显微镜，也就是对标本能有一个更好的观察方式，显微镜的照明方式很重。我们用显微镜的对比度来参考下：

光学显微镜中的对比度

当在光学显微镜中对样本进行成像时，强度和/或颜色的差异会产生图像对比度，从而使样本的各个特征和细节变得可见。对比度被定义为图像和相邻背景之间的光强度相对于整体背景强度的差异。一般来说，人眼需要0.02（2%）的最小对比度值来区分图像与其背景之间的差异。对于其他探测器，如胶片、摄像机或光电探测器（CCD和CMOS器件），最小对比度通常是不同的值。对于每个检测器，信噪比（噪声是光学系统中没有图像信息的所有光）必须足够大，以根据相干图像的形成来解释。

对比度产生的样品中的光的吸收，亮度，反射率，双折射，光散射，衍射，荧光，或颜色的变化一直是经典的手段，在明场显微镜成像标本。一个细节在背景或其他邻近细节中脱颖而出的能力是样本对比度的一个衡量标准。用一个简单的公式，对比度可以描述为：

对比度百分比（C）=（（I）（s）- I（b））× 100）/I（b)

其中I（B）是背景强度，I（s）是样品强度。从这个等式可以看出，样本对比度是指图像中最高和最低强度之间的关系。图1所示的曲线图说明了背景强度对对比度的影响。当背景是非常暗的灰色（I（B）等于0.01）时，图像强度的小变化会产生对比度的大变化。通过将背景变亮为稍微浅的灰色（I（B）等于0.10），图像强度的小变化提供了有用的对比度范围。在更浅的背景颜色（I（B）0.20）下，图像对比度对背景强度相对不敏感，并且I（B）的大的变化仅产生图像对比度的小的增加或减小。

虽然现代显微镜中的光学系统能够在高放大率下产生高分辨率图像，但如果图像中没有足够的对比度，这种能力就毫无价值。对比度不是样品的固有特性，而是取决于样品与光的相互作用以及光学系统的效率，光学系统的效率与其利用检测器可靠地记录该图像信息的能力相耦合。在显微镜光学系统中的图像对比度的控制取决于几个因素，主要是孔径光阑的设置，光学系统中的像差程度，所采用的光学对比度系统，样本的类型，以及光学检测器。显微镜中有几个位置可以调节对比度。这些包括视场孔径、聚光孔径、视频探测器的附加放大、电子照相机伽马、胶片伽马、打印纸伽马、真实的时间图像处理以及标本染色。

背景强度对图像对比度的影响

了解背景强度的微小变化如何产生图像对比度的巨大变化。

因为人眼通过在其图像中产生的对比度来感知对象，所以除非存在发生以在图像中产生对比度的光学事件的知识，否则可以容易地将人引入歧途。图2示出了在不同对比度模式下用光学显微镜成像的含有透明、无色的人颊细胞的相同视场的三张显微照片：明场、相衬和霍夫曼调制对比。很明显，这三个图像看起来是不同的，因为这些变化，显微镜可能会从每个视场得出不同的结论。图2（a）中所示的细胞用显微镜成像，该显微镜以明场模式操作，聚光器孔径关闭到足以使样品边缘可见。

图2（B）显示了使用相位对比光学器件的脸颊细胞的相同视场。请注意围绕对象边缘的暗的内部区域和亮的外部区域，例如细胞膜和细胞核（称为晕圈，是伪影）。在这种情况下，很难确定细胞的边缘，也很难解释图像中暗区和亮区的原因。细胞也显得相当扁平。最后，使用霍夫曼调制对比度对图2（c）中所示的细胞进行成像，其中图像的一侧是暗的，而其相对侧是亮的，导致伪三维物体的感知。图2中的每个视场提供了不同的样本图像，并导致不同的解释，这只能通过了解显微镜如何创建这些图像来破译。

对于光学显微镜中的许多标本，特别是未染色或活体材料，对比度非常差，以至于无论物镜是否能够分辨或清楚地分离细节，标本基本上都是不可见的。通常，对于这样的标本，重要的是不要通过杀死或用化学染料或固定剂处理来改变它们。这种必要性导致显微镜实验对比度增强技术超过一百年，试图提高标本的可见性，并带来更多的细节图像，而不改变标本本身。通常的做法是将聚光镜孔径光阑减小到推荐尺寸以下或降低载物台聚光镜以增加样品对比度。不幸的是，虽然这些操作确实会增加对比度，但它们也会严重降低分辨率和锐度。

在讨论光学显微镜中控制对比度的方法之前，考虑光和物质如何相互作用的特性是有用的。负责照亮样品的光可以是空间相干的、非相干的或部分相干的。例如，光束可以以狭缝或环形的形式成形，并且可以由在垂直于传播方向的所有方向上振动或由于偏振而在单个方向上振动的选定波长组成。

一些标本被认为是振幅对象，因为它们吸收光的一部分或全部，因此可以很容易地观察到使用传统的明场显微镜。其他天然着色或人工染色的化学染料也可以清晰地成像与显微镜。这些污渍或自然色吸收一部分通过的白色光，并透射或反射其他颜色。通常，染色剂被组合以产生对比色，例如，蓝色苏木精染色用于细胞核，粉红色伊红染色用于细胞质。通常的做法是在不容易吸收光的标本上使用染色剂，从而使这样的图像对眼睛可见。

其他样品不吸收光，被称为相位物体。由于人眼只能检测强度和颜色差异，因此必须将物体引起的相位变化转换为强度差异。相位样品的特征在于几个标准，包括它们的形状（通常是圆形或扁平），内部光散射元素的密度，厚度和独特的化学或电学结构特性（统称为折射率）。厚的样品可能相对清晰，只包含少量的光散射元素，或者它们可能包含许多散射元素，这些散射元素不通过光，使样品对透射的照明有效地不透明。这些标本通常被称为反射光标本。

当考虑光学方法来增强样品对比度时，考虑样品的各种特性是有用的，这些特性可以被操纵以产生这些特性的强度变化，从而使它们可见。一个主要的问题是，在一组独特的情况下，物体的哪种特征将转化为不同的强度。

如果样本与其周围介质（环境）之间存在折射率差异，则尺寸接近成像光波长的样本细节和边缘将反射或散射光。折射率被定义为光通过空气或真空的速度除以光通过物体的速度的比率。因为光通过任何材料的速度都小于真空中的光速，所以用显微镜检查的样品的折射率总是超过1.0。为了分辨物体之间的小距离，并以合理的保真度再现它们的形状，显微镜物镜必须捕获大角度的衍射光。

衍射（或偏离）的物镜聚集的光必须在图像平面上形成清晰的焦点，以生成样品的细节，如图3所示。在像平面处，包括衍射光的光波经历与非衍射光的干涉。干涉后光的可见度在很大程度上取决于照射样品的光的相干性，随着相干性的增加，可见度成比例地增加。在光学显微镜中，聚光器孔径光阑开口尺寸控制着入射到样品上的光的空间相干性。减小光阑开口尺寸产生更大的空间相干性。

光的干涉

探索两种光波如何联合收割机产生相互干涉。

显微镜长期以来一直依赖于减少聚光器孔径光阑开口尺寸，以增加相位样品中颗粒和边缘的可见性。振幅物体的对比度也可以通过适当调整聚光器孔径来提高。小的物体、边缘和粒子将反射光，不管它们属于振幅或相位样本。由于物镜的数值孔径限制，只有一部分衍射光被物镜捕获（见图3）。未被收集的剩余衍射光表示丢失的图像信息。聚光镜孔径光阑开口尺寸的正确设置是样品图像对比度的增强和衍射伪影的引入之间的权衡。这些表现在分辨率的损失，衍射环的叠加，以及其他不期望的光学效应，源自在样品中的区域，是不是在共同的焦点。当接近衍射极限时，图像对比度随着物体细节变得更小和空间频率变得更大而变得更低。

Inoué和Spring已经描述了图像对比度与样品对比度的比率以及实际和理想化正弦图像所占据的位置的相移，当绘制为空间频率的函数时，作为光学传递函数（OTF）。在来自样品的光的分布变为正弦曲线的情况下，光学传递函数的模量变为调制传递函数（MTF）。随着空间频率的增加，调制传递函数减小，样品对比度降低。

对于每个物镜，特定的调制传递函数取决于物镜设计和数值孔径、对比度生成模式、照明光的波长和子级聚光器的数值孔径。物镜后焦平面的边缘充当衍射光的低通滤波器，衍射光必须聚焦在像平面处以发生干涉并形成颗粒或边缘的图像。聚焦显微镜将这些衍射光波聚集在中间像平面上。光波前相对于样品的角度决定了聚焦在光滑圆形表面的顶部或底部的困难程度，这些表面通常不包含衍射点。然而，球形样品或纤维的边缘很容易聚焦，因为边缘界面与波前成足够的角度并衍射光。

当讨论相位样品时，我们将把样品的任何可分辨部分定义为物体。许多对象将是平的或板状的，如图4所示。在该图中，物体具有厚度（t）和折射率n（s）。周围介质的折射率为n（m）。

光以光学路径OP = t（n（s））穿过样品，并以光学路径OP = t（n（m））穿过周围介质。光程差（OPD）可以表示为：

n = n （S） ， 则 tan （M 2 ） n = （S n = （M))

相位差为:

δ =（2π/λ）（OPD）

其中π是常数（3.14159265），λ是照射样本的光的波长。光程差是两项的乘积：厚度（t）和折射率差（n）。即使物体的厚度非常薄，OPD也通常非常大。另一方面，当样品和周围介质的折射率相等时，即使样品厚度很大，OPD也为零。在这种情况下，穿过物体的光相对于穿过等厚度的环绕物的光仅被延迟（相位差）。相位差是人眼无法检测到的。

光程差

检查样品厚度和折射率的变化如何影响样品及其周围环境之间的光程差。

相衬显微镜被设计成利用样品中的物体与周围介质中的物体之间的相位差。然而，这不仅仅是一个相位差是必要的，而且还必须从样品衍射相衬显微镜的工作发生。

相位物体最常见的形状是连续变化的光路或密度，如图5所示的半球形样品。在这种情况下，相位物体的侧面可以通过棱镜形状在数学上近似，如下所述。图5中相位物体的折射率表示为n（s），周围介质的折射率表示为n（m）。相位物体形状的根本几何转变仅发生在边缘A和B（见图5（a））。入射光垂直于平面AB撞击物体，而平面波前平行于AB。

1处的边界（图5（a）中圆形相位物体的顶点）基本上平行于入射波前，而A和B处的边界垂直。区域2至4是由相位物体的圆形表面的切线限定的微型棱镜（图5（B））。“棱镜”角在区域2处比在区域4处小，区域4与区域4'相对。在边缘A和B处衍射最强。

因此，弯曲物体由许多棱镜组成，并且物体的相对侧具有沿相反方向取向的棱镜。最陡的棱镜位于球形对象的赤道处，而斜率最小的棱镜位于顶部和底部。这些微型棱镜形成了一个光学梯度：

OG（光学梯度）= Φ = α（n（s）- n（m））

其中α是切线相对于平面波前的角度。请注意，光学梯度是两项的乘积：光线通过的两侧之间的角度（α）和折射率差（n（s）- n（m））。通过棱镜的光以角度Φ改变方向（见图5（c）和5（d））。如果折射率的差异大，则即使斜率或边界梯度可能小，方向的变化也可能大。如果折射率相同，光波通过相位物体时不发生折射。出射棱镜的光的方向取决于相位物体（n（s））和其周围介质（n（m）;见图5（c）和5（d））之间的折射率的相对差异。

位相物体中的光学折射率

发现相位物体形状和折射率的变化如何影响光线通过的过程。

正如我们上面讨论的，圆形相位物体具有连续变化的光学梯度，每个单独的光学梯度“棱镜”产生不同的光偏转角度。图5（c）示出了当周围介质具有大于相位物体的折射率（n（m）n（s））时的偏转方向，并且图5（d）示出了当相反情况成立时的方向（n（m）n（s））。偏转角Φ与正切角（α）和折射率差（n（s）- n（m））成比例，使得：

tan Φ=tan α(n(s）-n（m))

对于小角度:

Φ = α（n（s）- n（m））（弧度）

为了总结光学梯度边界的“棱镜”效应，当相位物体的折射率超过周围介质的折射率时，物体的每个斜面上相等大小的梯度以相同的角度偏转。该偏转角取决于相对折射率差和几何正切角（α）。当介质的折射率（n（m））大于物体的折射率（n（s））时，偏转与情况相反时相反。当没有梯度时，通过的光就没有偏转。

光可以通过各种机制与样品相互作用以产生图像对比度。这些包括来自表面的反射、吸收、折射、偏振、荧光和衍射。对比度也可以通过显微镜光学元件和照明模式的物理修改以及通过摄影或数字电子技术对最终图像的操作来增加。下面的讨论突出了标本和光之间的各种相互作用，并回顾了一些已开发的光学显微镜技术，以提高标本的对比度。

当入射光照射到不透明表面时，它会以特定于该表面地形的方式反射。非常光滑的表面反射光的角度等于入射光的角度，这种机制称为镜面反射。不均匀或漫反射的表面往往会通过漫反射现象以所有可能的角度反射光线，从而导致进入物镜的光量减少。反射光显微镜的对比度可以通过仔细的样品制备来提高。金相样品通常用反应性液体和气体蚀刻以显示晶界和/或抛光以增加反射到显微镜中的光量。染色，在荧光染料，薄膜和金属涂层的形式，也被用来引入反射光显微镜标本的对比度。双折射样品可以使用偏振反射光成像，透明相位物体通常是使用反射微分干涉对比、暗场照明和霍夫曼调制对比等技术观察的对象。

人眼对样品中的振幅和波长差异非常敏感。出于这个原因，许多标本被切成非常薄的切片（厚度范围从1-30微米），并用化学染料染色，以增加对比度和区分标本内的结构。这种技术在生物标本上已经使用了几百年。染料选择性地吸收一种或几种波长的光，并通过或反射所有其他波长的光。一个例子是蓝色染料，它吸收除蓝色以外的所有可见光波长，蓝色从样品反射并透射通过样品。生物样本的内部结构元素通常用染料的混合物染色以选择性地染色这些元素，增加它们与透明或染色不同颜色的材料背景的对比度。

这些技术也适用于荧光染料，可用于增加具有高度特异性的标本的对比度。当荧光标本用一种波长的可见光或近紫外光刺激时，它们通常会发出更长波长的光，从而变得可见或与现场或背景中的其他物体形成对比（图6）。荧光显微镜技术将在《显微镜入门》的另一节中详细讨论。

早期和目前使用的增加染色标本对比度的方法是在光路中使用颜色对比滤光片或干涉滤光片。例如，如果标本被红色染料染色，则绿色滤光片将使红色区域变暗，从而增加对比度。另一方面，绿色过滤器将使任何绿色染色区域变亮。彩色滤光片是非常有价值的辅助手段，以标本对比度，特别是当黑色和白色显微摄影是目标。nbsp;

各向异性材料通常表现出两个或更多个折射率，因此称为双折射或双折射。这类标本包括矿物、晶体（表现出高度的结构对称性）、纤维、毛发和其他生物标本。当光进入各向异性晶体的非光轴（光轴以外的轴）时，它被折射成两条光线，每条光线都偏振，其振动方向彼此垂直，并以不同的速度传播。所产生的光波被偏振，并且当在显微镜分析仪中重新组合时可以干涉，以产生高度着色并包含大量对比度的双折射样品的图像。

活体标本和其他相位物体，这往往会产生不良的图像时，在明场照明，是清楚可见的光学，而不是化学手段下观察时，相位对比度，霍夫曼调制对比度和微分干涉对比度照明。这些技术需要在显微镜的特殊光学元件，但通常会产生足够的对比度的图像，以揭示有关标本结构的重要细节。这些对比度增强技术的更全面的讨论可以在我们的专业显微镜技术部分找到。

另一个简单的对比度改善技术涉及到选择一个安装介质的折射率基本上不同的标本。例如，硅藻可以安装在各种对比度增强介质中，如空气或商业介质Styrax。折射率的差异提高了这些无色物体的对比度，使它们的轮廓和标记更加明显。下面的章节描述了许多更复杂的技术所使用的现代显微镜，以提高标本的对比度。

对比度增强技术

表1

表1总结了使用透射和反射光显微镜研究的各种标本和材料的对比度增强技术。此表可作为一个粗略的指南，以解决特定的成像问题，在光学显微镜。有关对比度增强的其他材料，请参见奥林巴斯显微镜资源中心显微镜入门的专业技术部分。