盖玻片厚度变化引起的球差

对于具有高数值孔径的显微镜物镜，位于前透镜元件和样品之间的介质的光学性质和厚度严重影响满足消球差和正弦条件以及校正图像像差所需的计算。

如果均质浸没物镜被设计成与浸没油、盖玻片和吸收样品的介质的折射率和色散匹配物镜前透镜元件的折射率和色散一起使用，则计算是直接的，因为所有的介质都可以被认为是前透镜元件的延伸。

然而，对于非浸没物镜，盖玻片可以成为色差的来源，其随着盖玻片厚度和色散而增加。 另一种光学伪影，球面像差，也与盖玻片的厚度成比例。 在设计不与均匀浸没一起使用的物镜时，假设在前透镜元件和样品之间存在标准盖玻片和其他特定光学介质。 当条件偏离这些指定的规格时，球面像差和彗差随着物镜的数值孔径而增加。 这是因为入射角的正切和正弦之间的差（其导致偏离校正这些像差所需的正弦条件）随着较长的数值孔径而变得更大。

当使用油浸物镜时，盖片厚度似乎只是有限的关注，因为其折射率近似匹配的浸渍油。 这是真实的，当标本是安装在加拿大香脂或其他封固介质的折射率类似的盖玻片。 然而，当标本被固定在例如生理盐水或其他水性介质中时，其折射率与盖玻片的折射率显著不同，这不再是真的。 在这些条件下，即使通过仅10微米厚的薄层水聚焦也会导致显著的像差和焦平面上下不再对称的点扩散函数（PSF）。这是因为油浸物镜的设计假定了载玻片是均匀浸入的。除非样本区域与盖玻片相邻（即使在含水环境中），否则用于计算像差校正的光学假设不再有效。

盖玻片矫正项圈

探索如何在物镜镜筒内平移整个透镜组以补偿盖玻片厚度变化。

一旦油浸物镜的这种特性被认识到，显微镜制造商开始生产良好校正的水浸物镜（1994年左右）。 配备校正环的Plan Apo水浸物镜的数值孔径约为1.2，并且（即使它们的数值孔径小于油浸物镜）能够克服通过水溶液成像的固有限制（见图2）。 最新的水浸物镜设计现在可以通过大约200微米的水介质聚焦，并且仍然保持出色的校正。 不幸的是，这些物镜的价格非常高，并且当聚焦在可伸缩组织或细胞元件内时，图像仍然会退化。

在盖玻片和测试光栅之间有和没有水层的情况下测量的60x/1.2数值孔径水浸和60 x/1.4数值孔径油浸物镜（均为平面复消色差仪）的对比度传递值见图2。 这些曲线图表明，即使水层厚达153微米，水浸物镜也能达到对比度传递的理论极限，而当测试光栅通过50微米厚的水层成像时，油浸物镜的对比度传递函数显著降低，分辨率极限减半。 连续线是在546纳米的波长处的相应数值孔径的无像差物镜的理论计算的对比度传递函数。

对于设计用于标准盖玻片厚度和折射率/色散（0.17毫米和n（D）= 1.515）的物镜，当物镜的数值孔径为0.4或更小时（如表1所示），偏离标准厚度并不过分关键。然而，对于高数值孔径的非均匀浸没物镜，问题变得特别关键，使得即使是一微米或两微米的盖玻片厚度的偏离也会使数值孔径为0.65或更大的高干燥物镜的图像劣化。 这个概念在图3中示出，图3呈现了计算出的点物体的图像中的最大强度与盖玻片厚度的偏差（与理想值0.17毫米的偏差）作为物镜数值孔径的函数。 为了补偿这种误差，校正良好的高干燥物镜配备有校正环，该校正环可用于根据盖玻片厚度调节其中间透镜元件的间距。 同样，设计用于通过硅树脂或塑料层或不同浸没介质（水、甘油、油）观察的物镜也配备有校正环。

盖玻片厚度变化导致性能下降

表1

盖板玻璃的标准厚度为0.17毫米，其被指定为1 ½号盖板玻璃。不幸的是，并非所有的1 ½盖玻片都是按照这种精密公差制造的，许多样品和盖玻片之间都有介质。对盖玻片厚度的补偿可以通过调整显微镜的机械镜筒长度来实现，或者（如前所述）通过利用专门的校正环来改变物镜镜筒内关键透镜元件之间的间距。 调整校正环以补偿这些细微的差异，并确保最佳的物镜性能。 正确应用物镜与校正衣领的要求，显微镜是有经验的和警觉的，足以重置衣领使用适当的图像标准。 在大多数情况下，在校正环的调整期间，焦点可能移位并且图像可能漂移。使用下面列出的步骤对物镜的校正环进行小的增量调整，同时观察样品图像的变化。

• 定位校正环，使物镜镜筒上的指示器标记与刻在校正环外壳上的0.17毫米刻度标记重合。

• 将样品放在载物台上，并将显微镜聚焦在小样品特征上。

• 轻轻旋转校正环并重新聚焦物镜，以确定图像是否有所改善或退化。由于大多数样品制备都存在盖玻片/介质夹层太厚的问题，因此首先尝试较大的补偿值（0.18-0.23）开始旋转实验。

• 重复上一步，确定当沿单一方向转动校正环时，图像是在改善还是在退化。

• 如果图像已退化，请按照相同的步骤，并以相反的方向（朝向较低的值）旋转校正环，以找到提供最佳分辨率和对比度的位置。

图1示出了具有0.85的数值孔径的60倍物镜的示例，该物镜配备有校正环，用于在表面处聚焦或通过厚度达1.5毫米的盖玻片聚焦，而不改变透镜系统的焦点设置。光学系统中心的可调透镜组是一个胶合的三联体，可以重新定位以适应盖玻片厚度的变化。

通过以上分析，我们对于盖玻片的使用有了一定的了解吧？欢迎一起探讨13817705659