浅析显微镜的图像亮度和物镜NA值的关系

显微镜的图像亮度和物镜NA值的关系？其实还真有，NA值也就是显微镜物镜的数值孔径，其大小关乎着显微镜图像的明亮度和清晰度，所以为什么越高端的显微镜用的物镜也就高端，因为他们的数值孔径大，所以用来看到的标本也就更明亮更清晰。

无论在光学显微镜中使用的成像模式如何，图像亮度都由物镜的聚光能力决定，这是数值孔径的函数。正如显微镜光源照明的亮度由聚光镜工作数值孔径的平方决定一样，样品图像的亮度与物镜数值孔径的平方成正比。

从以上抛物线可以看出数值孔径的大小会对显微镜图像的明亮度有着很大影响。

然而，与显微镜照明系统的情况不同，物镜放大率在确定图像亮度方面也起着重要作用。事实上，图像亮度与横向放大率的平方成反比：

其中NA是物镜的数值孔径，M是放大率。 上述公式中给出的比率表示透射照明中物镜的聚光能力（注意：落射照明的情况有些不同，如下所述）。 表1列出了具有不同光学校正度的选定物镜的聚光能力的示例。通常，具有高数值孔径的物镜也能更好地校正像差。 因此，对于相同的放大率，更高的数值孔径物镜收集更多的光，产生更明亮和更好的校正图像（见表1），整体图像更好地解决。

从检查表1中的数据可以明显看出，在物镜用于透照的情况下，在具有相同校正的一系列物镜中，随着放大率的增加，图像亮度迅速降低。 相比之下，利用类似的一系列物镜进行落射照明，随着放大率在较低范围（10倍至40倍）内的增加，产生越来越亮的图像，但在较高放大率下往往会降低。 同样明显的是，物镜在最高数值孔径值下在落射照明（与透照相对）中产生更亮的图像的趋势。

表1中使用的术语F（transs）和F（epi）是指物镜的聚光能力，并且根据以下等式计算：

理论上，照明强度取决于聚光器数值孔径的平方和光源图像缩小率的平方（实际上，根据平方定律，场光阑图像越小越亮）。 其结果是，样品图像的亮度与到达目镜（或相机系统）时的物镜数值孔径的平方成正比，并且与物镜放大率成反比。 因此，当在透射光下检查标本时，改变物镜而不改变聚光镜会影响图像亮度，以响应数值孔径和放大率的变化。

从以上表格中，我们可以看见在落射照明的情况下，同样的考虑适用，除了物镜也充当聚光器，并且在考虑图像亮度时必须考虑到这一点。 随着物镜放大率的增加，光源图像被减少（缩小）了等量，导致亮度水平更少地依赖于物镜放大率，而更多地依赖于数值孔径（亮度由落射照明中数值孔径的四次方决定）。 实际上，由于物镜后孔径大小的差异，图像亮度数值会有所不同（见表1）。

当光线水平受限时，应采用最高数值孔径物镜，但物镜和目镜的放大倍数应保持在与所需分辨率兼容的最低水平。 在许多情况下，制造商现在提供的油浸物镜具有更高的数值孔径，以及相应的更高的图像亮度值，而不是类似放大率的高干燥对应物。 例如，表1中的40倍平面复消色差浸没物镜的数值孔径是平面消色差40倍干物镜的两倍，并且在透射光中产生四倍的图像亮度。 这些物镜在落射荧光照明下产生16倍的图像亮度差异，高数值孔径油浸版本产生最亮的图像。 图2显示了低数值孔径物镜和高数值孔径物镜之间光锥尺寸的相对差异。 注意，较高数值孔径的物镜具有大得多的光锥、较大的内部透镜元件，并且能够比具有较低数值孔径的物镜从样本收集更多的光。

透射通过显微镜的光学部件的光量作为入射强度的函数，在荧光显微镜中尤其关键。 在高分辨率荧光成像需要高放大率且图像亮度损失最小的情况下，应采用具有最大透光度的最高数值孔径物镜。 如上所述，随着放大率的增加，整体图像亮度迅速下降，因此应仔细选择荧光显微镜的组件，以最大限度地提高通过光学系统的光量。

如上所述，利用落射照明的荧光显微镜配备有物镜，其用于聚光器和物镜的双重目的。 光通过激发过滤器和反射的二色镜表面的过滤立方体首先通过物镜形成一个倒置的锥形照明必要的激发标本。 然后，由附接到样本的荧光团发射的次级荧光被相同的物镜透镜系统收集，并在被投射到目镜或成像系统之前通过二色镜和屏障滤光器返回。 作为聚光器的高数值孔径物镜将以与数值孔径的平方成比例的方式增加信号（光）强度。 由于物镜的聚光能力也与数值孔径的平方成比例，因此图像亮度将根据以下等式随物镜数值孔径的四次方变化：

注意，在荧光显微镜中，亮度也与物镜放大率的平方成反比。因此，对于相同放大率的物镜，照明场和荧光图像两者的图像亮度随着物镜数值孔径而显著增加，这是制造商生产设计有用于荧光显微镜的非常高的数值孔径的物镜的主要原因。

用于观察样品的目镜进一步放大投影到显微镜中间像平面中的衍射极限图像，并且还用于降低样品的整体观察强度。 事实上，图像亮度与目镜放大倍数的平方成反比，因此需要使用具有最低可能放大倍数的目镜，以便方便地观察样本荧光。 因此，通过使用最高可用数值孔径物镜与最低功率目镜（尽管最常用的是10倍目镜），可以最大限度地提高荧光显微镜的图像亮度。 这些注释主要适用于具有均匀照明度的大样本区域。 在尖锐聚焦的点光源（例如，微小的荧光球）的情况下，颗粒图像应该是衍射限制的，并且具有与放大率无关的尺寸。

增加样本信号

在荧光显微镜中，图像亮度由照明强度、荧光团的量子产率和显微镜的聚光能力决定。 照明强度越大，量子产率越高，荧光信号越大，图像变得越亮，直到所有荧光团饱和。同样，在偏振光下，图像亮度由照明强度和样品的双折射延迟决定。 在高达四分之一波长的延迟值处，较大的延迟产生较大的双折射，并且因此产生较强的信号。

在这两种情况下，图像亮度由来自样品的信号控制，该信号是照明强度和样品引入的光的变化的产物。在发光的情况下，样品本身发光，图像亮度显然是由光的大小，或信号，由样品发出。

图3和图4分别针对荧光和偏振光样本说明了这一概念。 图3所示为一对夹竹桃叶片薄切片的数字图像，该图像是在配备有荧光照明器的体视显微镜上在落射照明条件下拍摄的。 当薄切片被激发与赋绿色荧光蛋白（GFP）过滤器组具有450和490纳米之间的带通范围，标本表现出弱的绿色自发荧光（图3（a）），这是高度可见的标本的某些部分，但在其他非常弱。 相比之下，激发的标本与较长的波长带通滤波器组（530-560纳米;图3（b））产生一个明亮的红色自发荧光与更强的信号在整个薄切片。

如图4所示，用偏振光显微镜观察矿物薄片也观察到类似的情况。 标本是一个抛光的30微米的斜长岩，一种几乎完全由长石组成的火成岩。 当高度取向的双折射薄片放置在光轴垂直于偏振器的位置时，通过检偏器的光（信号）被最小化（图4（a））。 然而，当光轴相对于检偏器和偏振器成45度角时（图4（B）），目镜或图像传感器接收的光量最大。

在其他显微镜模式中，例如相位对比、微分干涉对比（DIC）、暗场、霍夫曼调制对比等，可以独立地改变照明强度和图像对比度。 然而，来自图像的信号，即光学参数（例如，路径长度的差）的每单位变化的图像亮度的增量，将仍然由照明强度和光学参数的每单位变化产生的对比度的乘积来确定。 为了检测任何光学参数的微小变化，显微镜工作者应该最大化该特定参数变化所产生的信号。

通过显微镜的光传输

对于给定的聚光镜和物镜的数值孔径，放大倍率和照明器亮度，显微镜产生的图像亮度仍然可以根据通过光学组件的光透射而变化。 光透射取决于几个因素，包括透镜元件和胶合剂的吸收、光学界面处的反射损耗以及灯护套、漫射屏、滤光器、偏振器和其他辅助光学部件的透射率。 典型的传输曲线为选定的一组高数值孔径物镜如图1所示。 这些值或多或少代表了来自特定制造商的任何类别的物镜，但即使在测量这些曲线的特定类型中，确切的透射率值也会有所不同，例如，取决于单个透镜中使用的玻璃涂层和玻璃批次。

某些光学元件的透射率（透射强度占入射强度的百分比）甚至在可见光范围内也可能与波长有关，如图1所示。 此外，在可见光范围之外的波长处，透镜、棱镜、载玻片和用于样品的封固介质的透射率可以明显下降。 图1中所示的20倍平面荧光物镜透射率曲线说明了这一事实，该曲线显示随着波长在400和700纳米之间增加，透射率稳定下降。 该系列中的其他物镜没有表现出如此显著的波长依赖性。

现在已经开发了200多种光学玻璃配方，可供光学设计人员用于显微镜透镜，镜子，滤光片和分束器。 这些玻璃的性质，如折射率、色散、透射率、污染物、自发荧光的可能性、耐化学性和耐热性以及整体均匀性，通常经过仔细选择，以确保最大的光学性能。 然而，这些因素往往会损害其他要求，如在近紫外范围内的高透射率或高消光系数偏光显微镜。 一些新材料，如氟冠玻璃，接近天然萤石的性能，同时避免了其大部分缺点，如有机污染物和晶体微结构的存在，这可能会严重降低荧光和偏光显微镜的性能。 然而，完全复消色差校正仍然需要天然萤石和在近紫外范围内具有降低的透射率的玻璃。 理想的折衷方案通常是半复消色差物镜或萤石物镜，这是一种真正的多用途物镜，将出色的校正与良好的对比度、高数值孔径值和高光谱吞吐量相结合。

即使光学胶合剂厚度平均仅为约10微米或更小，放置在双合透镜或多个透镜元件之间的胶合剂也可能具有光谱吸收性质，这可能使物镜不适合于特定应用。在大多数情况下，光学玻璃和某些光学胶合剂的化学和光学性质通常是专有的。

玻璃-空气界面处的所有表面反射一些光并导致透射损失，即使当没有光的吸收并且光束垂直于界面入射时也是如此。 随着入射角的增加，反射和透射损耗以取决于光波振动方向（垂直或平行于入射平面）的取向的方式增加。 每个无涂层的空气-玻璃界面可以反射垂直于表面入射的4%到5%的光束（见图5）。 因此，在法向入射时，每次通过未处理界面的透射率为95%至96%。通过应用一个反射涂层（通常是一个四分之一波长厚的干涉膜，具有适当的折射率），在玻璃表面的光反射可以减少到百分之一或更少的一个中等范围的波长和入射角，如图5所示的波长范围在400和850纳米之间。

已经开发了多层反射涂层，它可以在更宽的波长范围内将空气-玻璃界面处的反射降低到0.1%。 大多数常用的多层干涉涂层都有轻微的绿色色调，而单层涂层的紫色色调则相反，这使得它们更容易识别。 某些偏振膜，特别是多层膜，对非垂直入射波表现出各向异性，可以显著降低偏振相关光学系统的消光系数。

随着物镜复杂性的增加，需要更多的透镜元件，这就强调了消除内反射以产生更高的透射率、更好的对比度和更少的光斑的需要。 这些特性对于入射光或反射光应用尤其重要。 追溯到20世纪40年代的单层玻璃涂层已经被改进并补充了多层涂层，将通过空气-玻璃界面的可见光谱范围内的透射率从约96%（未涂覆）增加到几乎99.9%（利用多层涂层，如上所述并在图4和图5中示出）。 图6示出了在具有1.5和1.8的折射率的玻璃表面上的多次反射的效果（分别为上图和下图）。 在较低的折射率（1.5）下，具有16个表面的8个元件，每个元件反射约4%的入射光，导致仅52%的吞吐量。 相比之下，较高折射率的玻璃元件（1.8），16个未涂覆的表面将仅通过26%的入射光。 单层无光涂层将透射率提高到85%，而多层涂层将该值提高到约94.6%。 这种吞吐量的增加和内部散射和噪声的相应减少显著增强了图像的对比度，因为它使亮特征更亮而暗特征更暗。

涂层材料是氟化镁或多种专有材料，所有这些材料都有自己的光学特性，可能会影响光学系统在给定光谱区域的透射率。一般来说，双折射涂层的干涉特性在光谱上是有限的，并且在可见光范围内的高透射率的相长干涉意味着在透射带之外的谐波相关频率中的相消干涉。

大多数具有高度光学像差校正的现代高数值孔径物镜包含多达15个单独的透镜元件和多达10-12个空气-玻璃界面。 如果透镜没有涂层，光是轴向光线的反射损失就会使物镜的透射率下降到大约50%。 在所有表面都涂覆单层或多层干涉膜的情况下，透射率可以提高到约86%至90%。

除了在物镜中发现的那些透镜元件之外，在现代显微镜的光学系统中可能存在两到四十个玻璃-空气界面：

• 灯箱和聚光器- 4-6个独立的透镜元件

• 内部光学系统-2-8反射镜、棱镜和中继透镜

• 滤光片- 2-8个透射或落射荧光单位

• 分束器—观测镜筒和摄像机系统中的1—4个单元

• 聚光镜- 4-8个透镜，取决于光学校正

• 样本-0-4，包括载玻片和盖玻片

• 目镜- 4-6个，取决于光学校正和设计

• 相机系统- 2-6个镜头、反射镜和滤光片

在极端情况下，当包括物镜时，可以有多达50多个光学接口。只有不到9%的轴向光线会透过60个未涂层界面的显微镜，而所有表面都有涂层的情况下，只有50%多一点。

高质量的透镜涂层不仅对于提高显微镜的透光率至关重要，而且对于减少由于玻璃表面的多次反射而产生的光斑也至关重要。 然而，即使是最好的涂层也不能在一定的波长范围内工作。对于某些波长，涂层甚至可以增加反射率（半波干涉膜是完美的反射器）。 对于使用CCD相机、光电二极管、光电倍增管或视频传感器的数字成像，这是需要记住的重要一点，其中光电探测器的灵敏度可以在距离人眼相当远的波长处达到峰值。

除了光学界面处的反射损耗之外，通过灯护套的光传输的阻挡可能降低图像亮度。 随着灯的老化，玻璃或石英护套可能会开裂或变暗，因为它失透或被从灯丝或电极蒸发的雾化金属涂覆或渗透。 值得注意的是，灯护套的透射率在紫外线区域比可见光区域下降得更快。 在这种情况下，用光度计测量的可见光亮度或亮度可能是水银或氙弧灯的紫外线输出的不良指标。

毛玻璃漫射屏只能透射正常光线3%以内的10%到15%的光线。在斜入射角下透射的光甚至更少。因此，无论何时必须最大限度地提高照明水平，都应避免使用毛玻璃漫射器。

滤波器和二色镜的透射率随着通带变窄而下降。许多干涉滤光片在峰值透射波长处仅透射入射能量的15%至30%。然而，某些选定的半透射带宽窄至50埃的多层干涉滤光片可以提供75%或更高的峰值透射率。

偏振和微分干涉对比（DIC）光学中使用的偏振滤光片也可以大大减少通过显微镜的光透射。即使当偏振器和检偏器轴在峰值透射时被设置为平行位置时，各自具有20%的自然光透射率的偏振滤光器组的透射率也仅为约8%。相比之下，高质量的方解石棱镜与抗反射涂层的盖板可以传输理论上最大的约50%的入射非偏振光每对。

图7所示为现代光学显微镜中的内部透镜元件的示意图，该显微镜被配置用于透射光和反射光照明和观察。 请注意，在显微镜底座中，灯和场透镜之间存在大量的玻璃-空气界面，垂直照明器中也存在类似数量的界面。 在观察镜筒和目镜的窗口、棱镜和透镜中，以及鼻镜和聚光器组件中，也存在大量接口。

如上所述，各种因素可以限制光通过现代显微镜的许多光学部件的传输。当一个人正在努力争取最高的分辨率，特别是在对比度增强模式下，图像本身是暗淡的，前面列出的所有因素都应该仔细检查。应该重申的是，通过整个显微镜的透射率由所有光学元件的透射率的乘积决定。

照明亮度

在配备有良好校正的照明器（包括聚光透镜系统）和聚光透镜的显微镜中，在科勒照明条件下，视场的照明度（照度）由许多因素决定，包括光源的固有亮度（平均发光密度）和光源的聚光透镜的焦距。此外，聚光透镜系统的数值孔径、聚光孔径可变光阑开口尺寸的设置以及照明系统的整体透射率有助于控制照明程度。

在科勒照明下，光源上每个点发出的光均匀地照亮显微镜视场光阑，以产生明亮且均匀分布的照明场（取决于光源的性质）。因此，视场光阑中开口的大小只影响照明视场的直径，而不影响其亮度。

如果聚光透镜的焦距不是太短而不能投射覆盖聚光器可变光阑的整个开口的光源的图像，则透镜的聚光能力或f值（直径/焦距）不会影响视场的照度。光源的平均发光密度和聚光器数值孔径的平方决定了视场的照度，前提是聚光器光圈开口充满光源的图像。聚光透镜的聚光能力和光源的尺寸仅在光源的图像不覆盖整个聚光器孔径时才影响场照度。

总之，平均发光密度（光源每单位面积的光输出）决定了图像亮度，而不是总光输出、光通量或光源面积。 来自光源的光通量是发光密度和光源面积的乘积，后者在确定平均发光密度时仅起次要作用。 由于光源的发光密度限制了场照度，因此图像的亮度永远不能超过光源的发光密度。 换句话说，光场永远不会比光源更亮，无论光学系统中使用了怎样巧妙的反射镜、棱镜、透镜或其他组件。 表2列出了在光学显微镜中有用的具有相对高的发光密度的几种照明源，并且包括诸如光通量、电弧尺寸和平均发光密度的规格。

应当注意，许多聚光弧光灯（水银和氙气）提供非常高程度的发光密度，并且在电弧上具有高度不均匀程度的光分布。 通常，电弧在靠近电极的微小点处最亮，即使在整体尺寸很小（低至0.3 × 0.3毫米）的电弧内也是如此。 当这样的电弧的图像被投射到聚光器孔径中时，不再存在照明强度的均匀分布。因此，由样品中的每个点产生的衍射图案偏离理想的艾里盘。 然而，这些弧光灯是必不可少的某些应用在显微镜（主要是荧光），因为高的平均发光密度。 这种情况的补救措施是采用一个单一的光纤（不是光纤束）光扰频器，可以添加到显微镜没有明显的平均照度损失。 图8示出了在由于照明强度的不均匀分布而导致场照明不均匀的情况下物镜后焦平面处的荧光图像。 在图8（a）中，样本图像被均匀地照亮，并且将可接受的图像投射到传感器上。 相反，在图8（B）中，样本在整个视场中没有得到适当的照明，并且将导致图像具有显著的强度波动程度。

显微镜载物台聚光镜是决定提供给样品的照明质量和程度的关键元件。 一些显微镜聚光器可以在聚光器顶部透镜和物镜前透镜之间使用或不使用浸没介质。 更常见的是，高质量的聚光器被设计用于具有特定折射率和色散的特定浸没介质。 可以是油、甘油、水或空气的介质填充在聚光器顶部透镜元件和样品载玻片的下表面之间的空间。

大多数暗场以及一些相位对比、微分干涉对比（DIC）和偏振光光学器件需要将聚光器浸没以实现高聚光器数值孔径。 当使用具有规定折射率和色散的正确浸没介质时，聚光器的设计可实现最佳性能和最小像差。 浸没免除了超过临界角的光的损失，消除了额外的折射，使光的反射损失最小化，并且减少了可以以高入射角散射或反射光的光学界面的数量。 这样的散射和反射成为耀斑的源，并且还改变偏振光的状态，从而减少高数值孔径偏振光学系统中的消光。总之，聚光镜的浸没影响视场照度以及图像质量。 为实现最佳性能，设计为浸入式的冷凝器应浸入正确的介质。

虽然视场照度随聚光镜数值孔径的平方而增加，但将聚光镜可变光阑打开得太远，超过匹配的物镜数值孔径，会产生光斑。此外，错过物镜孔径的照明部分产生叠加在明场图像上的暗场图像，从而降低图像对比度。

结论

如上所述，在光学显微镜中，视频传感器或摄影胶片平面上的曝光面积与放大率的平方成比例。 因此，图像亮度随放大倍数的平方而减小。一般来说，显微镜是用来暴露在一个标本的细节，但在同一时间，显微镜是一个强大的聚光仪器。 就像望远镜或双筒望远镜可以提高我们在夜间的视力一样，显微镜的聚光能力可以有效地用来捕捉微弱照明物体的图像。

根据必须可视化的标本的特征，如果收集更多的光而不是提高放大率，图像可能会变得更有意义。 对于一些发光和荧光标本，光水平可能是如此之低，一个高度放大的图像变得不可见或不可检测，因此完全没有意义。 在这种情况下，可以通过收集更多的光来使图像更清晰，方法是将光随时间积分（如果样本是静态的），或者降低图像的放大率。

对于极低的光水平的情况下，可以最大限度地提高图像亮度，通过使用最高的数值孔径物镜在最低的总放大率。在某些情况下，使用目镜来减小而不是增加中间图像的放大率甚至是有益的。

为了使传感器分辨率与物镜的分辨能力相匹配，一般倾向于提高投影到CCD传感器或视频拾取设备上的图像的放大率。 由于图像亮度会以放大倍数的平方下降，并且传感器只能在有限的强度范围内工作，因此增加放大倍数可能会导致亮度水平下降到传感器的灵敏度以下。 如果样品是静止的或变化非常缓慢，信噪比可以显着提高通过积分图像在几个帧时间，通过求和或平均信号，或更好的是，通过集成光电子在传感器本身。 在这种情况下，牺牲时间分辨率来改善空间信息。 无论如何，在试图提高分辨率和试图降低噪声水平之间经常存在拔河和妥协，随着图像变得越来越暗，噪声水平急剧上升。 当图像的亮度受到限制时，显微镜必须仔细微调仪器放大倍数以达到最佳平衡。

通过以上的分析，咱们对于显微镜的物镜数值孔径和显微镜的图像清晰度和亮度有了大概的了解了吗？欢迎详询13817705659，咱们一起学习探讨哦