微分干涉显微镜的基本构造

在显微镜的各种观察方式中，微分干涉绝对是很好的一种观察模式，我们应该咋样选择微分干涉显微镜呢？微分干涉显微镜又是啥构造原理呢？

在20世纪50年代中期，一位名叫Georges Nomarski的法国光学理论家修改了用于检测样品中的光学梯度并将其转换为强度差的Wollaston棱镜。目前，这种设计有几种实现方式，统称为差分干涉对比（DIC）。活的或染色的标本，这往往会产生穷人的形象时，在明场照明，使清晰可见的光学，而不是化学手段。

在透射光DIC中，来自灯的光以类似于偏振光显微镜的方式通过位于载物台聚光器下方的偏振器。 接下来在光路中（但仍然在聚光器下方）是一个经过修改的沃拉斯顿棱镜，它将入射的偏振光分成两束，以略微不同的方向传播。 沃拉斯顿棱镜是由两个胶合在一起的石英楔形物组成，从其中射出的光线以90度相对振动，具有轻微的路径差。不同放大率的物镜需要不同的渥拉斯顿棱镜。 沃拉斯顿棱镜通常装在聚光镜上的旋转塔上，这使得显微镜工作者在改变放大倍率时可以将适当的棱镜旋转到光路中。

分裂光束进入并穿过样品，在那里它们的波路根据样品的不同厚度、斜率和折射率而改变。 这些变化会导致两个光束的波路发生变化，这些光束通过任何样品细节的区域，靠近在一起。 当平行光束进入物镜时，它们被聚焦在后焦平面上方，在那里它们进入第二个修改的沃拉斯顿棱镜，该棱镜在棱镜本身外部的定义距离处组合两个光束。 这将消除光束对之间的剪切和原始路径差。由于已经穿过样品，平行光束的路径对于样品的不同区域不具有相同的长度（光程差）。

为了使光束干涉，不同路径长度的光束的振动必须被带入同一平面和轴。 这是通过将第二偏振器（分析器）放置在上沃拉斯顿光束组合棱镜上方来实现的。然后，光向目镜前进，在那里可以观察到强度和颜色的差异。 这种设计会导致细节的一侧显得明亮（或可能是彩色），而另一侧显得较暗（或另一种颜色）。这种阴影效果赋予标本一种伪三维的外观。

在某些显微镜中，上部改进的渥拉斯顿棱镜与其上方的检偏器结合在一起，上部棱镜也可以水平移动。这允许通过移动棱镜来改变光程差，从而为用户提供改变背景和样品的亮度和颜色的机制。由于棱镜的设计和位置，无论选择什么颜色，背景都是均匀的。

图像中显示的颜色和/或光强度效应特别与折射率、样品厚度或两者的变化率有关。 标本的方向可以有明显的影响，浮雕般的外观，通常，旋转180度的标本改变了一个山谷或反之亦然山。 三维外观并不能代表样品的真实几何性质，而是基于光学厚度的夸大。它不适用于实际高度和深度的精确测量。

与相差显微镜相比，DIC显微镜具有许多优点。 利用DIC，可以更充分地利用系统的数值孔径，并提供光学染色（颜色）。DIC还允许显微镜实现出色的分辨率。 使用完整的物镜孔径使显微镜能够集中在一个薄的平面部分厚标本，而不会混淆图像从上方或下方的平面。 在相衬中经常遇到的令人讨厌的光晕在DIC图像中不存在，并且合适的消色差物镜和萤石物镜可以用于这项工作。

缺点是塑料组织培养容器和其他双折射标本在DIC中产生混淆的图像，因此霍夫曼调制对比度被推荐用于组织培养工作。 此外，高品质复消色差物镜现在被设计为适合DIC。 图3显示了绿头苍蝇口器的透射和反射光DIC显微照片（透射DIC;图3（a））和硅酸铁合金中的表面缺陷（反射DIC;图3（b））。 两张显微照片均使用具有10倍物镜的延迟板拍摄。

DIC显微镜所需的设备包括一个偏振器，一个分束修改沃拉斯顿棱镜下面的聚光器，一个光束重组修改沃拉斯顿棱镜上面的物镜，和一个分析仪上面这个上棱镜。 聚光镜下方需要单独的棱镜（对于每个物镜）（图4）。对于上棱镜，单个棱镜可以用于所有物镜。上棱镜可以横向移动。

下棱镜相对于聚光器前焦平面的放置距离和上棱镜相对于物镜后焦平面的距离是非常关键的。因此，制造商指定哪些物镜适合于他们特定的DIC仪器。

DIC聚光镜包含四个或更多棱镜，一个带孔径光阑的明场开口，用于常规明场工作，和/或几个光环。 光环，加上相位物镜，使显微镜之间的相位对比和DIC图像进行快速比较。一个可旋转的偏振器安装在棱镜下面。 使用全物镜孔径可以聚焦在厚样品的薄平面上，而不会混淆来自被聚焦平面上方或下方的图像;这称为光学切片。更大的孔径在光学显微镜中也产生更好的分辨率。

图像中显示的颜色和/或光强度效果特别与样品细节或相邻区域的折射率、厚度或两者的变化率有关。图像显示为三维。这种外观并不代表样品的真实几何性质，而是基于光学厚度的夸大，不适合实际高度和深度的精确测量。光学厚度是指由折射率或实际厚度或这两个变量的某种组合的变化引起的光路变化。

如上所述，在可移动上棱镜的灰色设置下，三维性最显著。试样的取向可以显著改善浮雕状外观。有时，样品旋转180度会将山丘变成山谷，反之亦然;因此，必须谨慎地解释图像。细节一侧的较暗外观和另一侧的较亮外观通过提供伪浮雕效果大大提高了可见性。

要配置DIC对比度增强显微镜，应考虑以下步骤：

• 将DIC聚光镜放入显微镜的载物台聚光镜保持器中，并将DIC Wollaston棱镜安装到带槽的鼻镜座或每个物镜后面的槽中。使用10倍物镜和位于明场（0）位置的聚光镜以及光路中的偏光镜，将样品放置在载物台上，设置科勒照明。将样品移出光路，并取下其中一个目镜。

• 将一个相位聚焦望远镜插入目镜镜筒，在观察物镜后焦平面的同时，旋转上棱镜的螺丝，直到你看到一条斜黑线出现在物镜背面的中心。现在稍微旋转子台偏光镜，使黑线尽可能呈现黑色。实际上，这是调整偏振器，使其与位于上棱镜上方的分析器交叉（以90度角）。确保聚光镜孔径光阑打开到物镜后透镜直径的2/3到4/5。

• 取下调焦望远镜，将普通目镜装回目镜筒。旋转聚光器转台，使适当的下部棱镜进入光路;这通常由转台上的红色或白色10设置标记。将样品移回到光路中。现在您可以使用上棱镜的旋钮来回横向平移样品，以获得所需的效果或颜色。您也可以旋转载物台来改变样品的方向以改善效果。

• 对每个使用的物镜采取类似的步骤，通过调整视场和孔径光阑，确保显微镜为每个物镜的科勒照明正确配置。

与相位显微镜相比，DIC显微镜具有许多优点：

• 它可以更充分地利用系统的数值孔径，因为与相衬显微镜不同，没有子台环来限制孔径;适当地利用科勒照明。

• 不存在相位图像中可能遇到的混淆光晕。

• 图像可以看到醒目的颜色（光学染色）和三维阴影样外观。轮廓和细节的可见性大大提高，这些图像的显微摄影在颜色和细节上都很引人注目。

• 如果制造商声明这种物镜是为他们的设备设计的，则可以使用常规的平场消色差物镜或消色差物镜（也适用于普通明场工作）。

DIC有几个缺点或限制：

• DIC的设备相当昂贵，因为需要许多棱镜。

• 在许多晶体中发现的双折射样品可能不适合，因为它们对偏振光有影响。类似地，样本载体，例如培养容器、皮氏培养皿等，由塑料制成的可能不合适。对于这样的标本，霍夫曼调制对比度可能是一个更好的选择。

• 对于非常薄或分散的样本，使用相衬方法可以获得更好的图像。

• 复消色差物镜可能不合适，因为这样的物镜本身可能会显著影响偏振光。

再一次，像许多对比增强技术一样，我们发现在聚光器的前焦平面和物镜的后焦平面处的光的操纵对通过目镜可视化的图像的外观具有显著的影响。