谈荧光显微镜的荧光寿命与显微镜成像

2020-09-25 15:10:04 admin 0

荧光显微镜的荧光寿命与显微镜成像

用于分析荧光寿命的相量分析方法不需要任何拟合。Phasor FLIM(荧光寿命成像显微镜)提供了寿命分布的二维图形视图。该图形视图使任何观察者都能快速区分和分离FLIM图像中的不同寿命种群。相量FLIM分布的解释很简单。因为每个物种都有特定的相量,所以可以在单个像素内解析多个分子物种。

图1:左:用Alexa555-鬼笔环肽和H2B mCherry标记的细胞。使用FLIM相量执行分离。右:相量图清楚地显示了两种分布。图片由德国康斯坦茨大学生物学系MartinStöckl博士提供。


相量图如何生成?

当使用时间分辨单光子计数(TCSPC)系统获取数据时,相量FLIM分布是从傅立叶变换中得出的(Digman等,2008)。图像中的每个像素对应于相量图中的一个点。

图2:FLIM图像和相量图之间关系的示意图。图像中的每个强度像素值在相量图中都有一个对应的点。


图3:相量图,带有“通用圆”。还显示了用于任意寿命测量的水平(g)和垂直(s)分量。


规则:相量的代数

相量方法中只有很少的规则,它们使寿命分布的解释变得简单。最重要的三个如下所示(E.Gratton,2018)。

  1. 单指数寿命位于万能圆线上。

    图4:通用圆线上的单指数寿命


  2. 多指数寿命位于通用圆内,是其单个指数寿命成分的线性组合


    图5:万能圈内的多指数寿命。


  3. 一种用于多指数寿命(实验测量)的线性组合的比例决定的组分的分数(f 1和f 2从他们的两个单指数寿命)(τ 1和τ 2)。



    图6:由一个多指数寿命的线性组合之比确定的两个单指数寿命。


使用相量的优势

Phasor FLIM是一种非常强大的分析工具,可用于分子种类分离和FRET分析,尤其是在供体具有多指数寿命(这是CFP [蓝绿色荧光蛋白]的典型特征)时(Caiolfa等人,2007)。此外,相量FLIM与STED相结合,可让您使用更少的STED功率来达到相同的分辨率(Lanzanò等,2015)。

图7:左图:用具有FLIM功能的SP8 STED系统成像的加塔珠。右图:通过在相量图中突出显示使用寿命长的像素,可以提高STED图像的分辨率。