细胞培养液里面的活细胞显微镜成像

2020-09-18 14:26:47 admin 1

观察和分析活细胞的挑战

在固定细胞或组织中,获取有关样品“分子状态”的信息已经是一项艰巨的任务。如果必须实时获取信息,这将变得更加困难,因为实验过程中的细胞必须尽可能自然地运转。另外,由于许多事件仅持续几秒钟甚至几毫秒(例如,细胞离子水平的变化),因此必须在相对较短的时间内采样大量信息。

解决这些挑战性需求的一种方法是将某些光学方法统称为活细胞成像。活细胞成像允许研究活细胞中的动态生理过程,而不是给出细胞当前状态的“快照”。它将快照变成电影。活细胞成像提供了单个细胞,细胞网络(原位)甚至整个生物体(体内)中动态分子事件的时空信息。这些功能使活细胞成像成为解决细胞生物学,癌症研究,发育生物学和神经科学中的生理问题的必要技术。

近年来,电子,光学和生物化学领域的重大进步使活细胞成像易于科学家使用。使用优化的显微镜,专用光源,高速相机,高度灵敏的检测器和专门开发的荧光标记,当今的活细胞成像方法既提供了技术成熟又创新的工具集,可满足研究单细胞或整个细胞网络的挑战性要求在分子水平上实时进行。

具有线粒体标记(MitoRed®)和荧光钙染料(Fluo-4)的细胞的活细胞成像

图1:装有荧光钙染料Fluo-4的睾丸支持细胞的原代培养。注意钙染料的分布类似于细胞内钙的分布。

图2:用线粒体标记MitoRed®染色的睾丸支持细胞的原代培养。


图3:图1和2的合并。请注意钙热点和线粒体的共定位。


图4:培养的睾丸支持细胞的DIC图像。


用共焦显微镜Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像软件获取的图像。由德国亚琛工业大学化学研究所第二生物学研究所Sophie Veitinger博士提供。现在的地址:德国马尔堡菲利普斯大学细胞生物学和细胞病理学研究所的Sophie Veitinger博士

相应的出版物(非图像来源):
嘌呤能信号动员小鼠Sertoli细胞,Veitinger S,Veitinger T,Cainarca S,Fluegge D,Engelhardt CH,Lohmer S,Hatt H,Corazza S,Spehr J,Neuhaus EM, Spehr M;生理学杂志。2011年11月1日; 589(Pt 21):5033-55


活细胞成像的一般问题

活细胞成像通常可以通过培养的细胞系(例如HEK细胞,HeLa细胞),原代细胞培养物(例如皮肤细胞,神经细胞),急性切片制剂(例如脑切片)或整个器官或生物体来进行。一个主要任务是在实验过程中使细胞保持健康状态,因为细胞会遭受光毒性并被带离其“自然”环境。


单元外解决方案

使用不同类型的人工细胞外溶液(林格氏溶液,人工脑脊髓液(ACSF)和培养基(例如Leibovitz L-15))为细胞提供必需的离子和其他辅助因子,以维持其生理功能。用于活细胞成像的范围从非常简单的“咸”溶液(例如林格氏溶液)到相当复杂的混合物(例如Leibovitz L-15)。

但是,所有解决方案的共同点都包括一个pH缓冲系统,因为暴露于环境中会极大地改变介质的pH值(通常为7.2.-7.4)。在许多细胞外溶液中,pH缓冲是通过添加两性离子有机化学物质10–20 mM HEPES(2- [4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)来实现的。不幸的是,对于许多细胞,细胞外溶液不能用HEPES或其他化学缓冲液(例如MOPS,TES)缓冲,因为培养基中缺乏pH缓冲碳酸氢盐会损害细胞。为了克服这个问题,必须将二氧化碳输送到细胞外溶液中(当与细胞外溶液接触时,二氧化碳被转化为碳酸氢盐)。这可以通过两种方式来实现:一种是不断地输送气态二氧化碳(通常以碳素形式存在):95%的氧气和5%的二氧化碳)注入细胞外溶液,并不断地为细胞提供超融合作用。该方法通常用于具有比细胞培养更高的代谢周转率的切片制剂。

另一种常见的方法是将细胞保存在设计用于规定气氛和许多情况下温度的培养室中。在这种文化中,不断提供5-7%的二氧化碳,可以严格控制温度。但是,要确定一种化学缓冲的细胞外溶液是否足以使细胞保持良好状态,或者是否有必要输送二氧化碳甚至使用气候室,就必须考虑所用样品的类型和持续时间。实验。在许多情况下,化学缓冲溶液足以用于细胞培养和较短的实验。处理急性切片通常需要充足的二氧化碳供应,因为新陈代谢的转换率更高。但是,对于许多细胞类型和长时间的实验,必须使用气候箱。


光毒性

用荧光染料在活细胞成像中的另一个问题是激光或高强度电弧放电灯的入射光对细胞造成的损害,即所谓的光毒性。光毒性主要是在合成荧光染料被激发时发生的。在它们的激发态下,它们中的许多与分子氧反应并产生自由基。为避免光毒性,必须选择尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间,以使入射的高能光的剂量尽可能低。在实验设计期间,必须考虑实验的持续时间。在长期实验中,通常不需要高帧频。因此,图像采集的周期频率通常可以从例如大于每秒10帧显着降低到每秒1帧甚至更低。

人们可能还会考虑更改图像采集设置,因为在大多数情况下,可以通过将摄像机功能用作合并或提高增益或使用特殊的弱光摄像机(例如EMCCD摄像机)来改善低强度荧光信号。这样做,可以在不增加激发持续时间或光强度的情况下实现更好的信噪比和信号质量,而这两者都会导致更高的光毒性。此外,选择具有长激发波长的荧光团可防止光毒性,因为与具有短激发波长的荧光团相比,传递给样品的能量较低。荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)通常无光毒性,因为它们的光敏位点位于多肽被膜覆盖的蛋白质内部。


焦点漂移

此外,焦点漂移的发生,特别是在长期实验中,可能是活细胞成像实验中的一个问题。可以通过使用配备有软件或硬件控制的自动对焦的成像设置来避免这种情况。

图5:接种了cow豆花叶病毒(CPMV)的豆原叶(Vigna unguiculata“ California Blackeye”),该containing叶花叶病毒包含在病毒RNA 2中的移动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CPs)之间插入的GFP基因。所述GFP是丰度表达为游离蛋白(因此不是融合至MP或CP),并且可以在细胞质和受感染的表皮的核局部化和叶肉细胞。由实验室生物分子科学系Joan Wellink博士提供。分子生物学博士和植物植物科学系扬·范·伦特博士 荷兰瓦赫宁根农业大学病毒学系。


视频1:用DIOC6染色的活洋葱鳞茎细胞,同时进行透射光检测;使用共焦显微镜Leica TCS SP2 AOBS RS 购得,物镜63倍,变焦1.5,平均两倍折线,格式512 x 265,每秒4.7帧。


视频2:用表达GFP融合蛋白的构建体瞬时转染的COS细胞。主要的胞质蛋白在细胞中形成针头。每5秒记录3D堆叠(10.14 μm),每堆叠14个切片,持续10分钟。对于电影,使用堆栈的最大投影。512 x 512像素,双向扫描,缩放2,物镜HCX APO L UVI 63.0 x 0.90 W UV。图片由Jocelyn Laporte,EquipeGénétiqueHumaine,IGMBC(伊尔基希,法国)中心影像提供。


用于活细胞成像的方法

用于活细胞成像的宽视野和共聚焦显微镜技术的范围也非常广泛。通常,使用复式显微镜和对比方法(例如相差和微分干涉(DIC))随时间观察细胞的生长,细胞聚集或细胞运动。此外,通常使用体视显微镜或宏观镜对大型标本(例如发育中的斑马鱼胚胎)进行延时成像。在过去的几十年中,先进的荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜的应用迅速增加,已将生物学研究的视角从平面改变为三维。


图2:用线粒体标记MitoRed®染色的睾丸支持细胞的原代培养。


图3:图1和2的合并。请注意钙热点和线粒体的共定位。

图4:培养的睾丸支持细胞的DIC图像。


用共焦显微镜Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像软件获取的图像。由德国亚琛工业大学化学研究所第二生物学研究所Sophie Veitinger博士提供。现在的地址:德国马尔堡菲利普斯大学细胞生物学和细胞病理学研究所的Sophie Veitinger博士

相应的出版物(非图像来源):
嘌呤能信号动员小鼠Sertoli细胞,Veitinger S,Veitinger T,Cainarca S,Fluegge D,Engelhardt CH,Lohmer S,Hatt H,Corazza S,Spehr J,Neuhaus EM, Spehr M;生理学杂志。2011年11月1日; 589(Pt 21):5033-55


活细胞成像的一般问题

活细胞成像通常可以通过培养的细胞系(例如HEK细胞,HeLa细胞),原代细胞培养物(例如皮肤细胞,神经细胞),急性切片制剂(例如脑切片)或整个器官或生物体来进行。一个主要任务是在实验过程中使细胞保持健康状态,因为细胞会遭受光毒性并被带离其“自然”环境。


单元外解决方案

使用不同类型的人工细胞外溶液(林格氏溶液,人工脑脊髓液(ACSF)和培养基(例如Leibovitz L-15))为细胞提供必需的离子和其他辅助因子,以维持其生理功能。用于活细胞成像的范围从非常简单的“咸”溶液(例如林格氏溶液)到相当复杂的混合物(例如Leibovitz L-15)。

但是,所有解决方案的共同点都包括一个pH缓冲系统,因为暴露于环境中会极大地改变介质的pH值(通常为7.2.-7.4)。在许多细胞外溶液中,pH缓冲是通过添加两性离子有机化学物质10–20 mM HEPES(2- [4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸)来实现的。不幸的是,对于许多细胞,细胞外溶液不能用HEPES或其他化学缓冲液(例如MOPS,TES)缓冲,因为培养基中缺乏pH缓冲碳酸氢盐会损害细胞。为了克服这个问题,必须将二氧化碳输送到细胞外溶液中(当与细胞外溶液接触时,二氧化碳被转化为碳酸氢盐)。这可以通过两种方式来实现:一种是不断地输送气态二氧化碳(通常以碳素形式存在):95%的氧气和5%的二氧化碳)注入细胞外溶液,并不断地为细胞提供超融合作用。该方法通常用于具有比细胞培养更高的代谢周转率的切片制剂。

另一种常见的方法是将细胞保存在设计用于规定气氛和许多情况下温度的培养室中。在这种文化中,不断提供5-7%的二氧化碳,可以严格控制温度。但是,要确定一种化学缓冲的细胞外溶液是否足以使细胞保持良好状态,或者是否有必要输送二氧化碳甚至使用气候室,就必须考虑所用样品的类型和持续时间。实验。在许多情况下,化学缓冲溶液足以用于细胞培养和较短的实验。处理急性切片通常需要充足的二氧化碳供应,因为新陈代谢的转换率更高。但是,对于许多细胞类型和长时间的实验,必须使用气候箱。


光毒性

用荧光染料在活细胞成像中的另一个问题是激光或高强度电弧放电灯的入射光对细胞造成的损害,即所谓的光毒性。光毒性主要是在合成荧光染料被激发时发生的。在它们的激发态下,它们中的许多与分子氧反应并产生自由基。为避免光毒性,必须选择尽可能低的光强度和尽可能短的激发持续时间,以使入射的高能光的剂量尽可能低。在实验设计期间,必须考虑实验的持续时间。在长期实验中,通常不需要高帧频。因此,图像采集的周期频率通常可以从例如大于每秒10帧显着降低到每秒1帧甚至更低。

人们可能还会考虑更改图像采集设置,因为在大多数情况下,可以通过将摄像机功能用作合并或提高增益或使用特殊的弱光摄像机(例如EMCCD摄像机)来改善低强度荧光信号。这样做,可以在不增加激发持续时间或光强度的情况下实现更好的信噪比和信号质量,而这两者都会导致更高的光毒性。此外,选择具有长激发波长的荧光团可防止光毒性,因为与具有短激发波长的荧光团相比,传递给样品的能量较低。荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(GFP)通常无光毒性,因为它们的光敏位点位于多肽被膜覆盖的蛋白质内部。

焦点漂移

此外,焦点漂移的发生,特别是在长期实验中,可能是活细胞成像实验中的一个问题。可以通过使用配备有软件或硬件控制的自动对焦的成像设置来避免这种情况。

图5:接种了cow豆花叶病毒(CPMV)的豆原叶(Vigna unguiculata“ California Blackeye”),该containing叶花叶病毒包含在病毒RNA 2中的移动蛋白(MP)和衣壳蛋白(CPs)之间插入的GFP基因。所述GFP是丰度表达为游离蛋白(因此不是融合至MP或CP),并且可以在细胞质和受感染的表皮的核局部化和叶肉细胞。由实验室生物分子科学系Joan Wellink博士提供。分子生物学博士和植物植物科学系扬·范·伦特博士 荷兰瓦赫宁根农业大学病毒学系。

用于活细胞成像的方法

用于活细胞成像的宽视野和共聚焦显微镜技术的范围也非常广泛。通常,使用复式显微镜和对比方法(例如相差和微分干涉(DIC))随时间观察细胞的生长,细胞聚集或细胞运动。此外,通常使用体视显微镜或宏观镜对大型标本(例如发育中的斑马鱼胚胎)进行延时成像。在过去的几十年中,先进的荧光技术变得越来越重要。共聚焦显微镜的应用迅速增加,已将生物学研究的视角从平面改变为三维。