共焦显微镜的主光束分离装置

2020-09-15 15:41:34 admin 5


当前的荧光显微镜采用入射照明,其需要将照明和发射光分开。进行这种分离的经典设备是一个与颜色有关的分光镜,它具有固定的光谱参数,通常在指定的波段内透射90%至98%的发射光。透射率取决于波长,但也取决于技术,设计和实验要求。另一种选择是声光分束器(AOBS),它具有可自由调整的反射槽口。平均而言,发射的光的95%在这些狭窄的凹口之间透射。


为什么需要分束器?

微观技术的一种可能的细分是指将方向施加到微观对象上的方向(图1)。如果样品在光源和观察者之间,即样品被“射线照射”,则我们使用术语“透射光显微镜”。另一种方法是在被观察样品的同一侧进行照明,称为“入射光显微镜”。实际上,我们的日常生活观察主要与入射光有关:我们周围的世界被阳光或人造光源照亮。随后,我们认识到物体(例如树木,汽车,危险动物或人类)反射或散射的光。在特殊情况下,例如,如果您检查窗玻璃上的死蝇,则可能会发生透射光。

当您直接观察诸如蜡烛,夜空中的星星,萤火虫或您的电视屏幕(避免阳光)之类的光源时,在这种情况下,我们有第三种观察方式:“自我感知”发光物体”。这些物体不需要照明,因此,术语“入射光”和“透射光”不适用。

入射光显微镜已成为生物医学研究中最重要的技术,但在其他领域也是如此。特别是荧光显微镜的形式。光线被吸收,从而激发荧光分子-通常使用人工方法将其掺入样品中。经过一段时间的延迟后,能量从分子中释放出来,但具有比入射光更长的波长(斯托克斯位移)。

如果我们在检测发射信号的同一侧以期望的颜色照射样品,则必须以某种方式将激发光和发射光分开。为此,需要一个分束器。

图1:显微镜观察的照明模式:a)透射光b)入射光(具有色偏),c)自发光物体。D:检测器,S:样品,L:光源,Sp:分离器


经典方式:二向色镜

入射照明(也称为落射照明)可以通过以相对于显微镜光轴成一定角度的光照射到样品上来进行。罗伯特·胡克(Robert Hooke)在1665年已经描述了这种照明模式。这种方法在入射和透射照明之间的边界上的一种极端变化是光片显微镜(ultramicroscopy),其照明指向垂直于光轴。与光轴同轴照明的优点是,相同的高性能物镜可用于照明和检测。对于这种情况,我们必须在物镜后面的某个点将照明和检测分开。最简单的方法是在光束路径中插入一个半透明的镜子(图2“镜子”)。

图2:对于落射荧光,照明光(蓝光)通过半透明镜(左)或Leica声光分束器AOBS(右)施加到样品(在本例中为细胞)。荧光发射(红色射线)通过分离装置并到达检测系统,此处由眼睛指示。


图3:三色二向色镜的透射率(蓝色曲线,根据制造商的光谱调整)和为三个激光线编程的Leica AOBS的透射率(红色曲线,根据调整)。箭头表示激励槽口的窄度。与窄槽口相比,宽槽口可切除更多的荧光发射信号。


对于反射光,灰镜将是最佳解决方案。灰度镜既反射又透射相同数量的所有颜色,因此也称为50/50分束器。在荧光中,这种设计的缺点是失去了宝贵的荧光发射的一半。解决方法是使用非对称的灰色分离器,例如80/20甚至95/5分离器。在此,挽救了大部分的发射,但是浪费了大部分的激发光。该难题通过二向色分色器解决。它们显示出交替反射的高反射率和高透明度的光谱带,具体取决于设计。

二向色镜是通过在玻璃表面上沉积许多薄层介电材料制成的。设计和制造都很复杂。但是,仍然有大量非常不同的分束器可用。这些分离镜可用于单一类型的荧光或用于多种激发和发射(图3)。对于所有情况,反射镜必须反射特定波长带内的激发光,并在互补带内透射发射的光。发射效率由发射带的整体透明度和激发带的窄度定义。在多频带分离器的情况下,当激发带与荧光信号的发射带重叠时,效率降低。

电流二向色分束器在发射光谱范围内的传输效率通常在80%到98%之间-足够接近最大传输率。尽管如此,反射带的宽度通常低至50nm,在最佳情况下可能为20nm。如果激励线靠近传输开始的边缘,则这种带宽对于单用途分离器可忽略不计。但是,在大多数情况下,需要多个激发带,因此20-50 nm带宽会导致发射信号损失。

二向色分束镜的最重要参数是滤光镜的光谱参数不可修改的事实。如果需要改变激发和发射特性,则必须在光束路径中插入不同的分离镜。通常,滑块或轮子配备有许多不同的分离器,但很少超过5个。此方法有两个后果。首先,激发波长的可能组合受到限制。即使我们假设系统配备了8条激光线,那么255种不同的组合也是可能的。为了获得最佳性能,需要配备255个分离器的滤光片轮或滑片–并非切实可行的解决方案。因此,图3)。第二个障碍是这些过滤器的更换速度。对于快速改变照明方式,例如,需要顺序记录两组激发的情况或激发比染料的情况,滤光片组的交换速率至关重要。标准小工具提供的切换时间约为1秒。特殊设计可能达到0.1秒或更短。


通过声光晶体进行可调光束分离

在入射光系统中分离激发和发射信号的一种完全不同的方法是使用声光激活晶体的特性(图2“AOBS”)。这种设备的工作原理是基于这样一个事实,即施加到适当晶体上的声波会导致选择的颜色与残余光谱相比以不同角度离开晶体。可以通过施加的声波的频率和幅度来控制偏斜哪些颜色以及偏斜的程度。此外,可以施加整个系列的声波,从而偏转一组几乎自由选择的颜色。这种晶体在共聚焦显微镜中的首次应用导致在激发路径中替换了大范围的选择滤光片

第二种实现是替换主分束镜的存储库。此处,声光晶体以反向模式使用。声光器件强烈依赖于偏振,这对激光激发没有问题,因为无论如何激光都是偏振的。为了解决发射信号的极化分裂,必须采取适当的措施。我们将在下面简要介绍这种设备的设计。

激光耦合到第一个晶体中,并沿着显微镜的光轴从该晶体出射以激发样品(图4):

图4:声光分束器中的激发光路径。激发光(蓝色)通过镜子(m)沿显微镜的光轴和第一晶体(C1)的活动方向转移到所需的激发色。光将激发样品S中的荧光染料


图5:第一晶体(C1)中的发射光(红色)被其偏振分裂。在第二晶体(C2)中补偿了这种分裂。所有发射光均沿光轴射出C2并到达检测器(D)。


光线通过一个小镜子沿着显微镜的光轴耦合。当激光偏振时,元件的排列方式应使偏振方向可以激发样品。任何其他极化方向将以不同角度离开晶体。但是,激光仅包含一个偏振方向。可以通过在几微秒内重新编程来切换线路。由于编程频率可以自由调节,因此激发色也可以自由调节。如果需要一种以上的激发色,则将所有激光线以相同的方式同轴地同时馈入光路(无需多路复用)。同样,可以在几微秒内切换激发方式。

荧光发射通常不是偏振的。两个方向在第一个晶体中分开,需要合并(图5)。

两个偏振方向在第二个晶体中合并,并沿着显微镜的光轴离开该晶体。然后,通过针孔对光进行空间过滤,从而生成光学部分,就像在其他任何真正的共聚焦显微镜中一样。最后,将光分成光谱通道,进行检测并记录图像。

AOBS使用两个声光晶体,通过该发射光具有通过。透射率仍在95%-98%的范围内,如图3所示(红色曲线)。AOBS槽口宽度的2量级至6nm(波长依赖性),因此,较窄的约10倍相比,分色镜作为。图3所示的测量结果完美地揭示了在可调激发带之外(即在透射带中)约AOBS的透射率约为95%。

实际上,不同的颜色不会在同一位置离开第二个晶体。光线是平行的,但不是同轴的。这个结果会影响光学切片吗?由于光线是平行的,因此它们会聚焦在针孔所在的中间图像中的同一点上。AOBS系统的光学切片性能与采用不同方式分离激发光和发射光的系统相同。另一个问题是:色散会影响光谱性能吗?是的,的确可以,但是我们可以利用它:Leica SP-Detector®中的光谱分离是通过棱镜的色散实现的。SP对光谱“预分散”光束进行了优雅的处理-检测器,并且仅获得进一步的有益特性。


为什么AOBS优于二向色镜

声光分束器具有一系列有益的功能:

  1. 由于它是单个机械固定的设备,因此对各个元件进行不正确的调整永远不会有问题。

  2. 对产生的波进行电子控制可在10μs内快速切换线路。

  3. 透射更大比例的荧光发射具有很高的效率,因为反射的“带”保持在2到6 nm(取决于波长)的范围内,这非常窄。

  4. 由于晶体具有高性能的抗反射涂层,因此该器件的总体透射率对于荧光发射而言平均> 95%。

  5. 一种设备适用于任何激光线,因为可以将色带颜色调整为任何可见波长。

  6. 由于带子颜色可自由调节,因此AOBS是唯一使白光激光源与共焦显微镜耦合的装置。

  7. 可以对整个一系列的bandlets进行编程,从而使AOBS可以同时作为当前最多8种颜色的多波段分离器工作。当与白色光源结合使用时,可能的激发组合数量达到“万亿级”。

  8. 用户只需选择所需的激发色,共焦系统将安排适当的过滤和分离。无需对AOBS(主光束分离)和声光可调滤波器(AOTF;线路选择)进行单独控制,因为两者均由相同的设备操作。