探悉科勒照明在显微镜反射光中的应用原理

探悉科勒照明在显微镜反射光中的应用原理,首先我们要明白显微镜的各种照明方式。根据显微镜的使用要求和实验要求以及对标本的使用情况。显微镜的照明方式也是多种多样。有反射，投射，漫反射，光导管照射等等。今天咱们就来说说显微镜的反射，反射是显微镜明场观察较为常用的一种照明方式。

在明场反射光显微镜中，正确使用图1中所示的两个可变光阑，即孔径虹膜光阑（靠近光源）和场虹膜光阑（靠近样品），可以使用非常理想的科勒照明。

这些光阑在透射光中的位置与它们各自的位置相反，孔径光阑现在更靠近光源。这种照明提供均匀地分散在聚焦样本的视场的平面上的明亮光。科勒照明利用物镜数值孔径的最大份额提供无眩光的光，与良好的对比度和分辨率一致。

重要的是要注意，在这些反射光系统中，物镜具有双重功能：在下降的路上，作为一个匹配的良好校正的聚光镜正确对齐;在上升的路上，作为一个成像物镜，作为一个物镜的习惯角色，将携带图像的光线投射到目镜。 在透射光系统中，改变物镜需要调整聚光器的数值孔径以匹配新物镜的数值孔径。然而，在反射光中，物镜和聚光器的数值孔径随着新物镜同时改变。 共轭平面类似于透射光的共轭平面，光源的图像形成在物镜的后焦平面和孔径光阑光圈开口内。这有助于减少在反射光显微镜中建立科勒照明条件的复杂性。

科勒照明的一个功能（除了提供均匀分散的照明）是确保物镜能够提供出色的分辨率和良好的对比度，即使光源是线圈灯丝灯。 光圈光阑控制明场反射光中从全锥中的每个方位角照射样品的光的角度。物镜的数值孔径决定了从样品反射的光的角度。 在其他因素相同的情况下，数值孔径越高，物镜的分辨率越好，即物镜能够更好地清晰地分离靠近在一起的小细节。 该系统的垂直照明器包含光圈光圈，因此物镜本身的背面不必被遮挡。

在柯勒照明中，系统的布置（图2）使得灯泡线圈灯丝的图像在孔径可变光阑的平面上聚焦；它也在物镜的后焦平面上聚焦。 假设在照明器的光路中没有磨砂滤光片，当取下目镜时，可以在物镜的后面看到灯丝的图像。 在大多数系统中，灯罩外部有一组定心螺钉（图3），使您能够通过南北或东西方向移动灯丝来使灯丝居中。 而且，如上所述，在物镜的后焦平面处可观察到孔径可变光阑的关闭或打开。

视场可变光阑与聚焦样本、目镜固定光阑所在平面的中间像平面以及眼睛的视网膜共轭（预聚焦）。

反射光显微镜是越来越多的兴趣，特别是在其日益增加的实用性，在荧光显微镜。快速增长的半导体工业也导致反射光显微镜的使用增加，这在经典应用中仍然非常有用，如金相学，矿石岩相学和材料研究。

在实践中，首先用中等放大倍数的物镜（通常为10倍）对样品进行聚焦，然后关闭预聚焦场光阑的孔径，直到它在视场的外围可见。 如果视场可变光阑未居中，则使用垂直照明器上的居中螺钉将部分关闭的可变光阑开口移动到视场中心。 然后打开光阑，直到它从视野中消失或从显微照相分划板中的胶片框架所描绘的区域消失。 接下来，将灯丝置于中心并聚焦（如果工厂未进行此操作），并将孔径光阑设置为最佳样品对比度和图像质量。这些步骤将在以下各节中详细讨论。

目镜和视场光阑

• 选择具有高反射率的样品，以在初始科勒照明配置步骤中最大限度地增加反射回物镜的光量。理想的选择是在高反射硅、高度抛光的金属或光滑的金属薄膜上的集成电路。样品应具有一定程度的细节或纹理，可用于找到样品的焦平面。

• 将反射样品放置在载物台上，并激活光源，光源通常是位于类似于图3所示的灯罩中的钨卤素灯泡。旋转鼻镜，将中等放大率物镜（如10倍物镜）定位在样本对面。如果灯泡工作正常，一个直径约3毫米的小光圈应该由物镜投射到样品表面。

• 在观察物镜和样品的同时，使用粗调旋钮升高载物台，直到它位于物镜前透镜下方几毫米处。 非常小心，不要将样品推入物镜前透镜。 接下来，当通过目镜观察样品时，缓慢降低载物台，（首先）使用粗调焦旋钮，然后使用细调焦旋钮，直到样品细节成为清晰焦点。 如果对焦点丢失，重新开始，物镜前透镜和样品之间的距离略短。在许多情况下，如果样品在试图建立焦点时移动，则更容易找到正确的焦点。 通过旋转圆形360度载物台或使用机械载物台旋钮在视场中来回平移样品来实现这一点。

• 一旦标本聚焦清晰，调整双目显微镜上的瞳孔间距。每个目镜上的屈光度调整也应该在这个时候进行。

• 许多偏振和微分干涉对比（DIC）显微镜配备了圆形的刻度台，旋转一个完整的360度周围的显微镜的光轴。这些显微镜通常配备了单独的调整（通过调整螺丝在鼻梁架）为每个物镜，使物镜的光轴与显微镜的光轴同心。最好在继续之前进行此调整。



• 下一步是调整视场光阑，它是最靠近显微镜前面的虹膜光阑，如图4所示。有时，光圈直接在照明器外壳上标记为“F“或“Field“。 使用控制杆调节关闭视场可变光阑，直到开始看到视场中的树叶。继续关闭光阑，直到杠杆停止，目镜中只能看到一个小开口。 样品和光阑的叶片都应该在清晰的焦点上，通常在工厂进行设置，因为大多数现代反射光显微镜没有配备允许调整视场光阑的轴向位置（它不能聚焦）。 这是因为物镜同时也是聚光镜，因此在工厂预设了关键的焦平面，以最大限度地减少显微镜对准误差。 在大多数情况下，不同物镜的焦点和视场光阑中心之间会有微小的差异，但这种微小的波动通常可以忽略不计。

• 一组定心旋钮位于垂直照明器的外壳上，靠近视场光阑，允许用户将视场光阑置于视场中心。 使用这些旋钮将视场光阑图像居中，然后慢慢打开光圈叶片，直到光阑图像刚好在视场之外。 如果显微摄影是首要考虑的，视场光阑应打开足够的宽度，以允许在胶片框架中勾勒出的区域（刻在显微摄影标线上）可见。 更换物镜不需要调整视场光阑尺寸设置，因为新物镜也将充当聚光镜，并且关系保持不变。 这很容易通过将视场光阑关闭到与显微照相或测量分划板相关的预定尺寸来验证。 改变物镜后，视场中像的大小将改变，但视场光阑和分划板之间的尺寸关系不变。

灯丝排列和孔径调整

• 正如在透射光中使用科勒照明一样，在反射光中调整（"聚光器"）孔径光阑对于控制样品对比度、减少衍射和眩光伪影以及产生最佳图像质量至关重要。灯丝的图像应该在焦点上，并完全充满孔径光阑，类似于透射光的情况。

• 第一步是将灯丝居中并聚焦。 一些现代反射光显微镜（特别是高端研究型号）在外壳中配备了一个预先定心的卤钨灯，该外壳还配备了一个集光透镜和一个扩散屏。 对这些系统没有调整，但是许多较旧的落射照明系统具有必须居中的灯，并且为此目的提供调整机构。 第一步是移除（如果可能的话）玻璃漫射滤光片，该滤光片将照明均匀地散布在视场上。 接下来，使用调节旋钮（见图3）将灯丝居中，同时观察物镜后焦平面中的共轭像。 这是在一个类似的方式进行的透射光显微镜，其中目镜被删除，聚光器孔径和灯丝图像通过目镜管在物镜的后焦平面上查看。欢迎参观者和学生在以下交互式Java教程中探索灯丝排列：

• 当目镜从眼管上取下时，在物镜的后焦平面上应能看到灯丝的像（聚焦清晰），沿着部分闭合的孔径光阑。 通过使用相位望远镜、伯特兰透镜（通常在偏振光显微镜上发现的附件）或通过中心具有针孔的端盖来促进这种观察。 后者可以由目镜塞制成，用于在运输过程中保护显微镜的内部。如果毛玻璃扩散屏没有（或不能）被删除，一个均匀照明光盘应出现在灯丝线圈的地方。 如果灯丝没有居中，光盘中会出现“热点”，这可以通过调整灯箱上的螺丝来补救（图3）。不断进行增量调整，直到整个光盘上的照明均匀。

• 最后一步是调整孔径光阑的开口，通常由字母“A”或垂直照明器外部的单词“光圈”识别。在透射光显微镜中，每次将不同数值孔径的新物镜插入光路时，必须重新调整聚光镜孔径光阑。这是因为物镜和聚光镜是独立的实体，改变物镜数值孔径不会影响聚光镜。 为了补偿，聚光器孔径光阑必须打开或关闭，以提供与物镜的数值孔径相匹配的照明光锥。 然而，在反射光显微镜中，物镜也充当聚光器（如上所述，提供照明和成像光路），并且当选择新物镜时，数值孔径相应地改变。

• 确定孔径光阑的正确设置对于获得无衍射伪影、具有足够对比度和最高质量的图像至关重要。 通常，这是由于在最大化图像对比度而不引入由于折射和衍射引起的错误伪影之间达成折衷。 如上所述，在透射光显微镜中，孔径光阑必须随着物镜的每次变化而重置。 然而，在反射光显微镜中，物镜和“聚光镜”随着数值孔径的同时增加而变化，并且可以为孔径光阑选择单个设置。 该设置通常在60%和95%之间打开，但将因样品而异，并且将在很大程度上取决于样品的反射率。 高反射率的样品需要较小的光圈来减少眩光和增强对比度，但这最好是根据具体情况进行的。 最好的方法是先将光圈打开到最宽，然后慢慢关闭，同时观察样品以优化对比度。 在显微摄影中，通常明智的做法是将一组显微照片“括起来”，每张照片的孔径大小略有不同。

上述明场反射光显微镜的技术也适用于配备交叉偏振、荧光和微分干涉对比（DIC）的显微镜。事实上，显微镜可以调整科勒照明，而在任何这些模式，往往对比度增强可以互换，而无需重新调整显微镜照明的必要性。

以上就介绍了显微镜的反射光应用原理，是不是很繁琐啊？其实不管用哪种照明方式，目的就是为了更好的观察标本。只要适合自己的实验要求，照明就选择哪种方式。欢迎加微联系13817705659，敬请一起探讨哦。