奥林巴斯荧光显微镜的荧光观察(荧光显微镜的使用))

2021-08-09 15:51:56 admin 8

奥林巴斯荧光显微镜应用领域比较广泛,尤其是生命细胞,组织切片。病理切片组织的荧光工程观察提供了较为很好地观察氛围和体验,更能有效的完成实验的要求。下面我们就来探讨下荧光显微镜的荧光方面的各方面的具体形式和具体应用。欢迎指正。

当样本(活的或非活的、有机的或无机的)吸收并随后重新辐射光时,该过程被描述为光致发光。如果在激发能量(光)中断后光的发射持续达几秒钟,这种现象称为磷光。另一方面,荧光描述了仅在吸收激发光期间持续的光发射。荧光中激发光的吸收和再辐射光的发射之间的时间间隔非常短,通常小于百万分之一秒。

荧光现象在 19 世纪中叶就已为人所知。英国科学家乔治·G·斯托克斯爵士首先观察到矿物萤石在紫外线照射下会显示荧光,并创造了荧光一词。斯托克斯观察到荧光光的波长比激发光的波长长,这种现象被称为斯托克斯位移在图 1 中,紫外线辐射光子(紫色)与简单原子中的电子碰撞,激发电子并将其提升到更高的能级。随后,被激发的电子弛豫到较低的能级,并在可见光区域以较低能量的光子(红色)的形式发光。图 2 是电磁辐射的可见光区域的示意图,其覆盖了大约 400 700 纳米的波长范围。可见光区周围是能量较高的紫外光和能量较低的红外光。


荧光显微镜是研究可以发出荧光的材料的绝佳方法,无论是在其自然形式(称为初级自发荧光)还是在用能够发出荧光的化学物质(称为次级荧光)处理后。荧光显微镜是在 20 世纪早期由 August KöhlerCarl Reichert Heinrich Lehmann 等人设计的。然而,该仪器的潜力几十年来并未被意识到,荧光显微镜现在是细胞生物学中一个重要的(也许是必不可少的)工具。

早期的调查显示,许多标本,包括微量矿物质、晶体、树脂、生药、黄油、叶绿素、维生素和无机化合物,在紫外线照射下都会表现出自发荧光。然而,直到 1930 年代,奥地利研究员 Max Haitinger 和其他科学家才开发出二次荧光技术,该技术使用荧光染料标记特定的组织成分、细菌和其他不会自发荧光的病原体。这些标记为特定生化目标的荧光染料促进了荧光显微镜的使用。1950 年代,Albert Coons Nathan Kaplan 证明了抗原在与荧光素标记抗体反应的组织中的定位,从而显着提高了仪器的价值。

荧光显微镜的基本任务是允许激发光照射样品,然后将发出的较弱的荧光与较亮的激发光分开。因此,只有来自样品的发射光到达眼睛或其他检测器(通常是数字或传统胶片相机)。由此产生的荧光区域在黑暗背景下明亮地发光,具有足够的对比度以允许检测。非荧光材料背后的背景越暗,仪器的效率就越高。

3 显示了用荧光显微镜观察荧光样品时发生的图形表示。紫外线(UV) 特定波长或一组波长的光是通过使来自紫外线发射源的光通过激发滤光片而产生的。过滤后的紫外光照亮样品,在这种情况下是萤石晶体,当被紫外光照射时,它又会发出荧光。从样品发出的可见光(图 3 中的红色)然后通过一个不允许反射紫外线通过的屏障过滤器进行过滤。应该注意的是,这是唯一一种显微镜模式,在这种模式下,样品在激发后会产生自己的光。无论激发光的方向如何,发射的光都会在所有方向(超过 360 度角)重新呈球状辐射。

荧光显微镜是一种快速扩展且非常宝贵的研究工具。它的优势基于在其他光学显微镜技术中不容易获得的属性。荧光染料的使用使得在非荧光材料中以高度特异性识别细胞和亚显微细胞成分以及其他实体成为可能。更重要的是,荧光显微镜可以非常灵敏地揭示荧光材料的存在。可以检测到极少量的荧光分子(每立方微米少至 50 个分子)。在给定的样本中,通过使用多重染色,不同的探针将揭示单个目标分子的存在。

荧光显微镜技术可应用于有机材料、以前有生命的(生物)材料,或应用于生物材料(使用体外体内荧光染料)或无机材料(特别是在调查半导体晶片上的污染物时)还有越来越多的研究使用荧光探针来监测快速变化的生理离子浓度,例如钙和镁,以及活细胞中的 pH 值。

许多植物和动物组织以及材料样本在用较短波长的光(原发或自发荧光)照射时会发出固有的荧光。已发现自发荧光可用于植物研究、煤岩学、沉积岩岩石学和半导体工业。在动物组织或病原体的研究中,自发荧光通常非常微弱或具有非特异性,使得自发荧光的效用最小。对于此类样本而言,具有更大价值的是外源性荧光染料(也称为荧光团),它们被照射光激发,并且其最终产生的发射光强度更高。这种荧光称为二次荧光。

荧光染料是一种污渍,有点类似于众所周知的吸收可见光的组织污渍,它会附着在可见或亚可见的有机物质上。这些荧光染料能够吸收然后重新辐射光,通常在它们的附着目标方面具有高度的特异性,并且在吸收-发射比(称为量子产率的概念)方面具有显着的产。这使得荧光染料在生物应用中非常有价值。荧光显微镜使用的增长与数百种荧光染料的发展密切相关,这些荧光染料具有已知的激发(吸收)和发射强度曲线以及众所周知的生物结构目标。

4 所示的是荧光显微镜中最常用的两种荧光染料。流行的核酸染色剂 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 DAPI ),图 4 中的左侧分子,是一种吲哚衍生物,具有两个高度亲核的脒基部分,可用于核酸的荧光标记,并具有被广泛用于荧光分析以快速鉴定病原体。DAPI 最初是作为一种潜在的抗锥虫剂合成的,它优先结合腺苷和胸苷 AT) DNA 中的碱基对区域,并被最大吸收波长为 355 纳米的紫外光激发。染料在可见光谱的蓝色区域发出荧光。DAPI 分子的右侧(图 4)是另一种荧光染料,德克萨斯红,其在荧光偶联物中的特性已经过深入研究。这种荧光染料是为流式细胞术应用中的双标记而开发的,但在荧光显微镜中广泛用于代替罗丹明(另一种常见的荧光染料)进行抗体检测。

在许多情况下,德克萨斯红与 DAPI 和异硫氰酸荧光素 FITC )结合使用,可用于因染料的红色、蓝色和绿色荧光而观察到的多重染色标本。在决定用于荧光显微镜的标签时,必须牢记所选的荧光染料应该有很高的吸收激发光的可能性,并且应该保持附着在目标分子上。荧光染料还应该能够提供令人满意的发射荧光产量。


荧光显微镜最重要的应用之一是在免疫荧光领域。活体动物会制造无数抗体,这些抗体与白细胞一起用于中和任何进入的异物,例如病毒、细菌和含有或产生抗原的外来蛋白质。抗原-抗体反应是高度特异性的,通常以图解方式比作锁和钥匙的关系。免疫荧光的成功归功于荧光显微镜的灵敏度和免疫学表现出的高度特异性之间的结合。

在直接免疫荧光法中,通过化学连接荧光染料以形成所谓的偶联物来标记特定抗体,然后将其铺展在显微镜载玻片上,该载玻片含有怀疑存在的已知可刺激抗体产生的特定抗原。如果存在抗原,则标记的抗体偶联物会与抗原结合,并在洗涤后保持与样本的结合。当荧光染料在其激发峰值处被激发时,可以证明化学连接的荧光偶联物和抗原的存在,然后可以目视观察或通过检测器系统(数字或传统相机)捕获不同波长的后续发射强度。

另一种常用的技术称为间接免疫荧光,其中可能含有未标记抗体及其相关但已知的抗原的血清一起孵育。然后将与抗人抗体(如果被测样本是人)结合的荧光染料放置在含有未标记抗体抗原的载玻片上。如果确实发生了抗原抗体反应,则荧光染料标记的抗人抗体会将自身附着在抗原和抗体形成的复合物上。随后,抗原、抗体和荧光染料标记的抗人抗体的标记组在该荧光染料的峰值波长强度处被激发,并观察到任何产生的发射。间接免疫荧光技术减少了库存大量标记抗体的必要性,并且通常还会产生更大的荧光强度。

荧光研究的一个重要领域涉及细胞化学和组织化学染色。荧光染料已被用于识别染色体、DNA 含量、蛋白质、细胞结构、激素和维生素。荧光显微镜是此类研究中的强大工具,因为所选荧光染料具有极高的灵敏度,而且它们对样品中极少量的物质具有特异性。事实上,尽管荧光显微镜的空间分辨率受限于数值孔径和衍射极限所控制的通常规则,但荧光探针可以通过发射光通过使荧光材料可见,即使这些材料仅存在于亚分辨率量(如几个分子)。

一组新兴的荧光显微镜应用涉及将荧光探针(荧光染料)应用于活体材料,包括体外(玻璃中)和体内(生活中)。由于可能的毒性所施加的限制,这些探针的困难成倍增加。此外,由于生命过程和细胞内结构运动的不断变化的性质,必须对时间间隔给予相当多的关注。荧光研究已应用于重要生物离子(如氢 (pH)、钙和镁)的结合和未结合离子浓度变化。

其中最著名的是使用流行的荧光探针Fura-2对细胞内钙的研究。对于这种染料,可以在单个发射波长下监测大约 340 380 纳米的双激发(使用光斩波器和双激发滤光片或单色器),每个激发波段独立测量。控制显微镜的主机用于计算比率(在称为比率成像的过程中)荧光)与游离细胞内钙结合,如荧光发射强度的变化所示。比率方法的优点是,除了双近紫外激发波长外,基本上所有因素都保持不变,每个波长都会在可见光谱的绿色部分产生发射。使用称为Indo-1的探针进行类似类型的比率成像。对于这种也用于测定细胞内结合和未结合钙的荧光染料,采用单一激发波长,但在两个波长中的每一个测量发射以区分结合钙和未结合钙。