奥林巴斯荧光显微镜BX53的荧光激发模块

2022-03-03 10:06:24 admin 6

当我们使用荧光显微镜的时候,荧光是怎么产生的?还有荧光波长是怎么一回事?我们怎样选择适合的荧光激发模块呢?下面我们以奥林巴斯荧光显微镜BX53来做一个实例演示吧。

当有生命或无生命、有机或无机的标本吸收并随后重新辐射光时,该过程被描述为光致发光如果在激发能量(光)中断后,光的发射持续长达几秒钟,这种现象称为磷光另一方面,荧光描述了仅在吸收激发光期间持续的光发射。荧光中激发光的吸收和再辐射光的发射之间的时间间隔非常短,通常小于百万分之一秒。

到 19 世纪中叶,荧光现象才为人所知。英国科学家乔治·斯托克斯爵士首先观察到矿物萤石在紫外线照射下会发出荧光,并创造了“荧光”一词。斯托克斯观察到荧光光的波长比激发光长,这种现象被称为斯托克斯位移在图 1 中,紫外线辐射的光子(紫色)与简单原子中的电子碰撞,激发电子并将其提升到更高的能级。随后,被激发的电子弛豫到较低的能级,并在可见光区域以较低能量的光子(红色)的形式发射光。图 2 是电磁辐射的可见光区域的图解表示,它覆盖了大约 400 到 700 纳米的波长范围。围绕可见光区的是高能紫外光和低能红外光。

荧光显微镜是研究可发出荧光的材料的一种极好的方法,无论是天然形式(称为初级荧光或自发荧光)还是用能够发出荧光的化学物质(称为次级荧光)处理时。荧光显微镜是由 August Köhler、Carl Reichert 和 Heinrich Lehmann 等人在 20 世纪初设计的。然而,这种仪器的潜力几十年来一直没有实现,荧光显微镜现在是细胞生物学中一个重要的(也许是必不可少的)工具。

早期的调查表明,许多标本,包括微量矿物质、晶体、树脂、生药、黄油、叶绿素、维生素和无机化合物,在紫外线照射下会表现出自发荧光。然而,直到 1930 年代,奥地利研究员 Max Haitinger 和其他科学家才开发出二次荧光技术,该技术使用荧光染料来标记特定的组织成分、细菌和其他不会自发荧光的病原体。这些标记到特定生化目标的荧光染料刺激了荧光显微镜的使用。该仪器的价值在 1950 年代显着提高,当时 Albert Coons 和 Nathan Kaplan 证明了抗原在与荧光素标记的抗体反应的组织中的定位。

荧光显微镜的基本任务是允许激发光照射样品,然后将发出的较弱的荧光与较亮的激发光分开。因此,只有来自样本的发射光到达眼睛或其他检测器(通常是数字或传统胶片相机)。产生的荧光区域在黑暗背景下发出明亮的光,具有足够的对比度以允许检测。非荧光材料背后的背景越暗,仪器的效率就越高。

图 3 显示了用荧光显微镜观察荧光样本时发生的事件的图形表示。紫外线(UV) 特定波长或一组波长的光是通过使来自紫外线发射源的光通过激发滤光片而产生的。过滤后的紫外线照射样品,在这种情况下是萤石晶体,当被紫外线照射时,它又会发出荧光。从样本发出的可见光(图 3 中的红色)随后通过不允许反射的紫外光通过的屏障滤光片进行过滤。应该注意的是,这是唯一的显微镜模式,在这种模式下,样品在激发后会产生自己的光。无论激发光的方向如何,发射的光都会在所有方向(超过 360 度角)以球面形式重新辐射。

荧光显微镜是一种快速扩展且非常宝贵的研究工具。它的优点是基于在其他光学显微镜技术中不易获得的属性。荧光染料的使用使得在非荧光材料中识别具有高度特异性的细胞和亚微观细胞成分和其他实体成为可能。更重要的是,荧光显微镜可以非常灵敏地揭示荧光物质的存在。可以检测到极少量的荧光分子(每立方微米只有 50 个分子)。在给定的样品中,通过使用多重染色,不同的探针将揭示单个目标分子的存在。

荧光显微镜技术可以应用于有机材料,以前是活的(生物)材料,或活的材料(使用体外体内的荧光染料)或无机材料(特别是在半导体晶片上的污染物调查中) . 还有越来越多的研究使用荧光探针来监测快速变化的生理离子浓度,例如钙和镁,以及活细胞中的 pH 值。

许多植物和动物组织以及材料标本在用较短波长的光(初级或自发荧光)照射时会固有地发出荧光。已发现自发荧光在植物研究、煤岩学、沉积岩岩石学和半导体工业中很有用。在动物组织或病原体的研究中,自发荧光通常要么非常微弱,要么具有非特异性,以至于使自发荧光的效用最小。对于此类样本而言,具有更大价值的是外在的荧光染料(也称为荧光团),它们被辐射光激发,其最终产生的发射光强度更高。这种荧光称为二次荧光。

荧光染料是一种染色剂,有点类似于广为人知的吸收可见光的组织染色剂,它们会附着在可见或亚可见的有机物质上。这些荧光染料能够吸收然后再辐射光,通常在它们的附着靶向方面具有高度特异性,并且在吸收-发射比(称为量子产率的概念)方面具有显着的产率。这使得荧光染料在生物应用中极具价值。荧光显微镜使用的增长与数百种荧光染料的开发密切相关,这些荧光染料具有已知的激发(吸收)和发射强度曲线以及易于理解的生物结构目标。

图 4 显示了荧光显微镜中最常用的两种荧光染料。流行的核酸染色剂 4',6-diamidino-2-phenylindole ( DAPI ),图 4 中的左侧分子,是一种吲哚衍生物,具有两个高度亲核的脒基部分,可用于核酸的荧光标记,并具有在荧光分析中被广泛用于病原体的快速鉴定。DAPI 最初是作为一种潜在的抗锥虫剂合成的,它优先结合腺苷和胸苷(AT) DNA 中的碱基对区域,并被最大吸收波长为 355 纳米的紫外线激发。染料在可见光谱的蓝色区域发出荧光。DAPI 分子的右侧(图 4)是另一种荧光染料 Texas Red,它在荧光偶联物中的特性已经过深入研究。这种荧光染料是为一种称为流式细胞术的应用中的双重标记而开发的,但在荧光显微镜中广泛用于代替罗丹明(另一种常见的荧光染料)进行抗体检测。

在许多情况下,德州红与 DAPI 和异硫氰酸荧光素 ( FITC ) 结合使用,可用于多重染色样本,由于染料的红色、蓝色和绿色荧光,可以观察到这些样本。在决定将哪个标签用于荧光显微镜时,必须牢记所选的荧光染料应该有很高的吸收激发光的可能性,并且应该保持附着在目标分子上。荧光染料还应该能够提供令人满意的发射荧光产率。

荧光显微镜最重要的应用之一是免疫荧光领域。活体动物制造无数抗体,这些抗体与白细胞一起用于中和任何进入的异物,例如病毒、细菌和含有或产生抗原的外来蛋白质。抗原-抗体反应具有高度特异性,通常以图解方式将其比作锁和钥匙的关系。免疫荧光的成功归功于荧光显微镜的敏感性和免疫学表现出的高度特异性之间的结合。

在直接免疫荧光中,通过化学连接荧光染料来标记特异性抗体以形成所谓的偶联物,然后将其散布在显微镜载玻片上,该载玻片怀疑存在已知刺激抗体产生的特定抗原。如果存在抗原,则标记的抗体偶联物与抗原结合,并在洗涤后保持与样品的结合。当荧光染料在其激发峰处被激发时,就证明了化学连接的荧光缀合物和抗原的存在,然后可以肉眼观察或通过检测器系统(数字或传统相机)捕获各种波长的随后发射强度。

另一种常用的技术称为间接免疫荧光,其中血清可能含有未标记的抗体及其相关但已知的抗原一起孵育。然后将与抗人抗体偶联的荧光染料(如果待测样品是人)放置在含有未标记抗体抗原的载玻片上。如果确实发生了抗原-抗体反应,则荧光染料标记的抗人抗体会将自身附着在抗原和抗体形成的复合物上。随后,抗原、抗体和荧光染料标记的抗人抗体的标记组在该荧光染料的峰值波长强度处被激发,并观察到任何产生的发射。间接免疫荧光技术减少了库存大量标记抗体的必要性,并且通常还导致更大的荧光强度。

荧光研究的一个重要领域涉及细胞化学和组织化学染色。荧光染料已被用于识别染色体、DNA 含量、蛋白质、细胞结构、激素和维生素。荧光显微镜是此类研究中的强大工具,因为选定的荧光染料具有极高的灵敏度以及它们对样本中极微量的特异性。事实上,虽然荧光显微镜的空间分辨率受限于由数值孔径和衍射极限控制的通常规则,但荧光探针可以通过发射光,通过使荧光材料可见,即使仅存在于分辨率数量(例如几个分子)。

一组新兴的荧光显微镜应用涉及将荧光探针(荧光染料)应用于活体材料,包括体外(玻璃中)和体内(生命中)。由于可能的毒性所施加的限制,这些探针的困难成倍增加。此外,由于生命过程和细胞内结构运动的不断变化的性质,必须对时间间隔给予相当多的关注。荧光研究已应用于重要的生物离子(如氢 (pH)、钙和镁)的离子浓度变化(结合和未结合)。

其中最著名的是使用流行的荧光探针Fura-2对细胞内钙的研究对于这种染料,可以在单个发射波长监测大约 340 和 380 纳米的双激发(使用光斩波器和双激发滤光片或单色器),每个激发带独立测量。控制显微镜的主机用于计算比率(在称为比率成像的过程中)如荧光发射强度的变化所揭示的,与游离细胞内钙结合的荧光)。比率法的优点是基本上所有因素都保持不变,除了两个近紫外激发波长,每个激发波长都在可见光谱的绿色部分产生发射。使用称为Indo-1的探针进行类似类型的比率成像。对于这种荧光染料,也用于测定细胞内结合和未结合的钙,采用单一激发波长,但在两个波长的每一个处测量发射以区分结合和未结合的钙。

以上就是我们初步的荧光知识的探讨,欢迎致电021-51602084详询。