显微镜图像的亮度

2022-03-01 14:25:45 admin 2

无论光学显微镜中使用何种成像模式,图像亮度都取决于物镜的聚光能力,这是数值孔径的函数。正如显微镜光源照明的亮度由聚光镜工作数值孔径的平方决定一样,标本图像的亮度与物镜数值孔径的平方成正比。

然而,与显微镜照明系统的情况不同,物镜放大倍率在确定图像亮度方面也起着重要作用。事实上,图像亮度与横向放大倍率的平方成反比

图像亮度∝(NA / M)2

其中NA是物镜数值孔径,M是放大率。上面等式中给出的比率表示物镜在透照中的聚光能力(注意:落射照明的情况有些不同,如下所述)。表 1 列出了具有不同光学校正程度的所选物镜的聚光能力示例。通常,具有高数值孔径的物镜也可以更好地校正像差。因此,对于相同的放大倍率,更高的数值孔径物镜收集更多的光,产生更明亮和更好校正的图像(见表 1),并且整体图像得到更好的解析。

通过检查表 1 中的数据可以明显看出,在使用物镜进行透照的情况下,在具有相同校正的一系列物镜中,随着放大倍率的增加,图像亮度会迅速降低。相比之下,使用类似系列的落射照明物镜会产生越来越亮的图像,因为放大倍率在较低范围(10 倍至 40 倍)中增加,但在较高放大倍率时往往会降低。同样明显的是物镜的趋势是在最高数值孔径值下在落射照明(与透射照明相反)中产生更亮的图像。

表 1 中使用的术语F(trans)F(epi)是指物镜的聚光能力,并根据以下等式计算

(反式) = 10 4 • NA 2 /M 2

(epi) = 10 4 • (NA 2 / M) 2

理论上,照明强度取决于聚光镜数值孔径的平方和光源图像缩小的平方(实际上,根据平方定律,视场光阑图像越小越亮)。结果是样本图像的亮度与到达目镜(或相机系统)时的物镜数值孔径的平方成正比,并且与物镜放大倍率成反比。因此,在透射光下检查标本时,在不改变聚光器的情况下改变物镜会影响图像亮度,以响应数值孔径和放大倍率的变化。

选定物镜的聚光能力
更正放大数值
孔径
F(反式)F(和)
计划消色差10倍0.256.250.39
计划萤石10倍0.309.000.81
计划 Apo10倍0.4520.24.10
计划消色差20 倍0.404.000.64
计划萤石20 倍0.506.251.56
计划 Apo20 倍0.7514.07.90
计划消色差40x0.652.641.11
计划萤石40x0.753.521.98
计划 Apo40x(油)1.3011.018.0
计划萤石60倍0.852.011.45
计划 Apo60x(油)1.405.410.6
计划 Apo100x(油)1.401.963.84
计划 Apo100x(油)1.452.104.42
计划 Apo100x(油)1.652.727.41
表格1

在落射照明的情况下,同样的考虑也适用,除了物镜也充当聚光镜,在考虑图像亮度时必须考虑到这一点。随着物镜放大倍率的增加,光源图像被等量缩小(缩小),导致亮度水平对物镜放大率的依赖性较小,而对数值孔径的依赖性更大(亮度由数值孔径的四次方决定)落射照明)。在实践中,由于物镜后孔径大小不同,图像亮度数会有所不同(见表 1)。

当光照水平受限时,应使用最高数值孔径物镜,但物镜和目镜的放大倍率应保持在与所需分辨率兼容的最低水平。在许多情况下,制造商现在提供的油浸物镜具有更高的数值孔径,以及相应的更高图像亮度值,而不是类似放大倍率的高干物镜。例如,表 1 中的 40x 平面复消色差浸没物镜的数值孔径是平面消色差 40x 干式物镜的两倍,在透射光下产生的图像亮度是其四倍。这些物镜在落射荧光照明下产生 16 倍的图像亮度差异,高数值孔径油浸版本产生最亮的图像。图 2 比较了低数值孔径物镜和高数值孔径物镜之间光锥尺寸的相对差异。请注意,与具有较低数值孔径的物镜相比,较高数值孔径的物镜具有更大的光锥、更大的内部透镜元件,并且能够从样品中收集更多的光。

作为入射强度的函数,透射通过显微镜光学组件的光量在荧光显微镜中尤为重要。在高分辨率荧光成像需要高放大倍率且图像亮度损失最小的情况下,应采用具有最大透光度的最高数值孔径物镜。如上所述,随着放大倍数的增加,整体图像亮度迅速降低,因此应仔细选择荧光显微镜的组件,以最大限度地增加通过光学系统的光量。

图像亮度

了解数值孔径和放大倍率的变化如何影响显微镜物镜产生的图像亮度。

开始教程

如上所述,利用落射照明的荧光显微镜配备了具有聚光镜和物镜双重用途的物镜。通过激发滤光片并从滤光片立方体中的二色镜面反射的光首先通过物镜,形成激发样品所需的倒置照明锥。然后,由附着在样品上的荧光团发出的二次荧光由同一物镜系统收集,并在投射到目镜或成像系统之前通过二色镜和屏障滤光片返回。用作聚光器的高数值孔径物镜将以与数值孔径的平方成比例的方式增加信号(光)强度。:

图像亮度(荧光)∝ NA 4 /M 2

请注意,在荧光显微镜中,亮度也与物镜放大倍数的平方成反比。因此,对于相同放大倍率的物镜,照明场和荧光图像的图像亮度随着物镜数值孔径的增加而显着增加,这是制造商生产设计用于荧光显微镜的非常高数值孔径的物镜的主要原因。

用于观察标本的目镜进一步放大了投射到显微镜中间像平面的衍射限制图像,并且还用于降低标本的整体观察强度。事实上,图像亮度与目镜放大倍率的平方成反比,因此需要使用尽可能低的放大倍率的目镜,以便方便地观察样本荧光。因此,可以通过使用与最低功率目镜耦合的最高可用数值孔径物镜来最大化荧光显微镜中的图像亮度(尽管最常用的是 10 倍目镜)。这些说明主要适用于具有均匀照明度的大样本区域。在锐聚焦点光源的情况下(例如,

增加样本信号

在荧光显微镜中,图像亮度由照明强度、荧光团的量子产率和显微镜的聚光能力决定。照明强度越大,量子产率越高,荧光信号越大,图像越亮,直到所有荧光团都饱和。同样在偏振光中,图像亮度由样品的照明强度和双折射延迟决定。在延迟值高达四分之一波长时,较大的延迟会产生较大的双折射,从而产生较强的信号。

在这两种情况下,图像亮度都由来自样本的信号控制,该信号是照明强度和样本引入的光变化的乘积。在发光的情况下,样品本身会发光,图像亮度显然受样品发出的光的大小或信号的控制。

图 3 和图 4 分别说明了荧光和偏振光样品的这一概念。图 3 中显示的是在配备荧光照明器的立体显微镜上在落射照明条件下拍摄的夹竹桃叶薄切片的一对数字图像。当薄切片用带通范围在 450 和 490 纳米之间的 Endow 绿色荧光蛋白 (GFP) 滤光片组激发时,样品会呈现出微弱的绿色自发荧光(图 3(a)),在某些部分高度可见。标本,但在其他方面非常弱。相比之下,用较长波长的带通滤光片组(530-560 纳米;图 3(b))激发样品会产生明亮的红色自发荧光,在整个薄切片中具有更强的信号。

用偏光显微镜观察矿物薄片也观察到类似的情况,如图 4 所示。该标本是磨光的 30 微米斜长岩切片,它是一种几乎完全由长石组成的火成岩。当高度定向的双折射薄切片的光轴垂直于偏振器时,通过分析仪的光(信号)被最小化(图 4(a))。然而,当光轴相对于检偏器和偏振器成 45 度角时(图 4(b)),目镜或图像传感器接收到的光量最大。

在其他显微镜模式中,例如相位对比、微分干涉对比 (DIC)、暗场、霍夫曼调制对比等,照明强度和图像对比度可以独立变化。尽管如此,来自图像的信号,即每单位光学参数变化(例如,路径长度的差异)的图像亮度增量,仍将由照明强度和每次产生的对比度的乘积决定。光学参数的单位变化。为了检测任何光学参数的微小变化,显微镜师应该最大化由该特定参数的变化产生的信号。

通过显微镜的光传输

对于给定的聚光镜和物镜数值孔径、放大倍率和照明器亮度,显微镜产生的图像亮度仍会根据通过光学组件的光传输而变化。光传输取决于几个因素,包括透镜元件和胶合剂的吸收、光学界面处的反射损耗以及灯罩、漫射屏、滤光片、偏振器和其他辅助光学组件的透射率。一组选定的高数值孔径物镜的典型透射曲线如图 1 所示。这些值或多或少代表了特定制造商的任何类别的物镜,但即使在测量这些曲线的特定类型中,确切的传输值可能会有所不同,例如,

一些光学元件的透射率(透射强度占入射强度的百分比)即使在可见光范围内也可能与波长有关,如图 1 所示。此外,在可见光范围之外的波长处,透镜、棱镜、载玻片的透射率,并且样品的封固剂会明显下降。图 1 所示的 20 倍平面荧光物镜透射曲线就是一个例证,该曲线显示随着波长在 400 到 700 纳米之间增加,透射率稳步下降。该系列中的其他物镜没有表现出如此明显的波长依赖性。

现已开发出超过 200 种光学玻璃配方,可供光学设计人员用于显微镜透镜、反射镜、滤光片和分束器。这些玻璃的特性,例如折射率、色散、透射、污染物、自发荧光的可能性、耐化学性和耐热性以及整体均匀性,通常都经过仔细选择,以确保最大的光学性能。然而,这些因素通常会影响其他要求,例如近紫外范围内的高透射率或偏光显微镜中的高消光因子。一些新材料,如氟冠玻璃,接近天然萤石的特性,同时避免了其大部分缺点,如有机污染物的存在和结晶微结构,这会严重降低荧光和偏光显微镜的性能。然而,完全复消色差校正仍然需要天然萤石和降低近紫外范围透射率的玻璃。理想的折衷方案通常是半复消色差或萤石物镜,它是真正的多用途物镜,结合了出色的校正和良好的对比度、高数值孔径值和高光谱吞吐量。

即使光学胶合剂的平均厚度仅为约 10 微米或更小,放置在双合透镜或多个透镜元件之间的胶合剂可能具有光谱吸收特性,可能会使物镜不适用于特定应用。在大多数情况下,光学玻璃和一些光学胶粘剂的化学和光学特性通常是专有的。

玻璃-空气界面处的所有表面都会反射一些光并导致透射损失,即使在没有吸收光并且光束垂直于界面入射时也是如此。随着入射角的增加,反射和传输损耗的增加取决于光波振动方向的方向(垂直或平行于入射平面)。每个未镀膜的空气玻璃界面可以反射 4% 到 5% 的垂直于表面入射的光束(参见图 5)。因此,在垂直入射时,每次通过未经处理的界面的透射率将是 95% 到 96%。通过应用抗反射涂层(通常是具有适当折射率的四分之一波长厚的干涉膜),对于中等波长范围和入射角,玻璃表面的光反射可以减少到百分之一或更少,如图 5 所示,波长范围介于400 和 850 纳米。

已经开发出多层抗反射涂层,它可以在更宽的波长范围内将空气-玻璃界面的反射降低到低至 0.1% 的值。大多数常用的多层干涉涂层具有略带绿色的色调,与单层涂层的紫色色调相反,这使得它们更容易识别。一些增透膜,尤其是多层增透膜,对于非法向入射波表现出各向异性,并且可以显着降低偏振相关光学系统中的消光因子。

随着物镜复杂度的提高,需要更多的镜头元件,这就强调需要消除内部反射以产生更高的透射率、更好的对比度和更少的眩光。这些特性对于入射或反射光应用特别重要。可追溯到 1940 年代的单层减反射涂层经过改进和多层涂层的补充,将可见光谱范围内通过空气-玻璃界面的透射率从大约 96%(未涂层)提高到近 99.9%(使用多层涂层,如上所述并在图 4 和 5 中说明)。图 6 说明了多重反射对折射率为 1.5 和 1.8 的玻璃表面的影响(分别为上图和下图)。在较低的折射率 (1.5) 下,八个元件有 16 个表面,每个表面反射大约 4% 的入射光,因此吞吐量仅为 52%。相比之下,折射率较高的玻璃元件 (1.8),16 个未镀膜的表面将仅通过 26% 的入射光。单层抗反射涂层将透射率提高到 85%,而多层涂层将此值提高到约 94.6%。这种吞吐量的增加以及内部散射和噪声的相应减少显着增强了图像的对比度,因为它使明亮的特征更亮,而黑暗的特征更暗。16 个未镀膜的表面只能通过 26% 的入射光。单层抗反射涂层将透射率提高到 85%,而多层涂层将此值提高到约 94.6%。这种吞吐量的增加以及内部散射和噪声的相应减少显着增强了图像的对比度,因为它使明亮的特征更亮,而黑暗的特征更暗。16 个未镀膜的表面只能通过 26% 的入射光。单层抗反射涂层将透射率提高到 85%,而多层涂层将此值提高到约 94.6%。这种吞吐量的增加以及内部散射和噪声的相应减少显着增强了图像的对比度,因为它使明亮的特征更亮,而黑暗的特征更暗。

涂层材料要么是氟化镁,要么是多种专有材料,所有这些材料都有其自身的光学特性,可能会影响给定光谱区域中光学系统的传输。一般来说,抗反射涂层的干涉特性在光谱上是有限的,在可见光范围内高透射率的相长干涉意味着在透射频带外的谐波相关频率上的相消干涉。

大多数具有高度光学像差校正的现代高数值孔径物镜包含多达 15 个单独的透镜元件和多达 10-12 个空气玻璃界面。如果透镜没有镀膜,仅轴向光线的反射损失就会使这些物镜的透射率下降到大约 50%。使用单层或多层干涉膜涂层的所有表面,透射率可以提高到大约 86% 到 90%。

除了在物镜中发现的那些透镜元件外,现代显微镜的光学系统中可能存在两到四打玻璃 - 空气界面

  • 灯箱和收集器- 4-6 个独立的透镜元件

  • 内部光学系统- 2-8 个反射镜、棱镜和中继透镜

  • 滤光片- 透射或落射荧光 2-8 个单位

  • 分束器- 观察管和摄像系统中的 1-4 个单元

  • 聚光镜 - 4-8 个镜头,取决于光学校正

  • 标本- 0-4,包括载玻片和盖玻片

  • 目镜- 4-6 取决于光学校正和设计

  • 相机系统- 2-6 个镜头、镜子和过滤器元件

在极端情况下,包括物镜在内的光学接口可能多达五打。不到 9% 的轴向光线会通过具有 60 个未镀膜界面的显微镜,而在所有表面均镀膜的情况下,只有 50% 多一点。

高质量的镜片镀膜不仅对于提高光通过显微镜的透射率是必不可少的,而且对于减少由于玻璃表面的多次反射引起的眩光也是必不可少的。然而,即使是最好的涂层也无法在一定的波长范围之外发挥作用。对于某些波长,涂层甚至可以增加反射率(半波干涉膜是完美的反射器)。这是使用 CCD 相机、光电二极管、光电倍增管或视频传感器进行数字成像时要牢记的重要一点,其中光电探测器的灵敏度可以在远离人眼的波长处达到峰值。

除了光学界面处的反射损失外,通过灯套的光传输受阻可能会降低图像亮度。随着灯的老化,玻璃或石英护套可能会因从灯丝或电极蒸发的雾化金属失透或变得涂层或渗透而开裂或变暗。值得注意的是,灯套的透光率在紫外区可能比可见区下降得更快。在这种情况下,可见亮度或用光度计测量的亮度可能是汞灯或氙弧灯紫外线输出的不良指标。

毛玻璃漫射屏仅能传输 10% 到 15% 的光,其传播范围在其正常范围的 3% 以内。以倾斜入射角透射的光更少。因此,只要照明水平必须最大化,就应该避免使用毛玻璃漫射器。

滤光片和二色镜的透射率随着通带变窄而下降。许多干涉滤光片在峰值透射波长处仅透射 15% 到 30% 的入射能量。然而,一些半透射带宽窄至 50 埃的选定多层干涉滤光片可以提供 75% 或更高的峰值透射率。

偏光和微分干涉对比 (DIC) 光学器件中使用的偏光滤光片也可以显着降低光通过显微镜的透射率。即使偏振器和检偏器轴设置在峰值透射时的平行位置,偏振滤光片组的透射率(每个都具有 20% 的自然光透射率)也只有 8% 左右。相比之下,带有抗反射涂层盖板的高质量方解石棱镜每对可以透射大约 50% 的入射非偏振光的理论最大值。

图 7 展示了现代光学显微镜中的内部透镜元件,该显微镜配置用于透射光和反射光照明和观察。请注意,在灯和场镜之间的显微镜底座中存在大量玻璃-空气界面,在垂直照明器中也有类似的数量。在观察管和目镜的窗口、棱镜、透镜以及物镜转换器和聚光镜组件中也有大量的接口。

如上所述,多种因素会限制通过现代显微镜的许多光学组件的光传输。在追求最高分辨率的情况下,尤其是在图像本来就暗淡的对比度增强模式下,应仔细检查前面列出的所有因素。需要重申的是,整个显微镜的透射率是由所有光学元件的透射率的乘积决定的。

照明亮度

在配备有良好校正的照明器(包括聚光镜系统)和聚光镜的显微镜中,在科勒照明条件下,视场的照明度(照度)受许多因素影响,包括固有亮度(平均发光密度) 和光源的聚光透镜的焦距。此外,聚光透镜系统的数值孔径、聚光孔径可变光阑开口尺寸的设置以及照明系统的整体透射率有助于控制照明程度。

在科勒照明下,从光源上每个点发出的光均匀地照亮显微镜视场光阑,以产生明亮且均匀分布的照明场(取决于光源的性质)。因此,视场光阑中开口的大小仅影响照明场的直径,而不影响其亮度。

选定光源的发光密度
电流
(安培)
光通量(流明

平均发光
密度 (cd/mm 2 )
圆弧尺寸
(H × W)
(毫米)
水银弧
(100 瓦)
5220017000.25 × 0.25
氙弧灯
(75 瓦)
5.48504000.25 × 0.50
氙弧灯
(500 瓦)
30900035000.30 × 0.30
钨-卤素82800454.2 × 2.3
表 2

如果聚光透镜的焦距不会太短,无法投射出覆盖聚光可变光圈整个开口的光源图像,则透镜的聚光能力或f值(直径/焦距)不会影响场的照度。光源的平均发光密度和聚光器数值孔径的平方决定了视场的照度,前提是聚光器光圈开口充满了光源的图像。聚光透镜的聚光能力和光源的大小只有在光源的像没有覆盖整个聚光孔径的情况下才会影响视场照度。

总之,平均光密度(光源单位面积的光输出)决定了图像的亮度,而不是总光输出、光通量或光源的面积。来自光源的光通量是光密度和光源面积的乘积,后者在确定平均光密度方面仅起次要作用。因为光源的发光密度限制了场的照度,所以图像的亮度永远不能超过光源的发光密度。换句话说,无论在光学系统中采用何种巧妙的反射镜、棱镜、透镜或其他组件的布置和组合,视场永远不会比光源更亮。

应该注意的是,许多聚光弧光灯(汞灯和氙气灯)提供了非常高的发光密度,并且在电弧上具有高度不均匀的光分布。通常,即使在整体尺寸很小(低至 0.3 × 0.3 毫米)的电弧中,电弧在靠近其中一个电极的微小点中也是最亮的。当这种弧形的图像投射到聚光器孔径中时,不再有照明强度的均匀分布。因此,样品中每个点产生的衍射图案偏离了理想的艾里斑。尽管如此,这些弧光灯对于显微镜中的某些应用(主要是荧光)来说是必不可少的,因为它们的平均发光密度。这种情况的补救措施是使用单根光纤(不是光纤束)光扰频器,可以将其添加到显微镜中而不会明显损失平均照度。图 8 显示了在由于照明强度分布不均匀而导致场照明不均匀的情况下,物镜后焦平面处的荧光图像。在图 8(a) 中,样本图像被均匀照亮,并将可接受的图像投射到传感器上。相反,在图 8(b) 中,样本在整个视场中没有得到适当的照明,将导致图像的强度波动很大。

显微镜台下聚光镜是确定提供给样品的照明质量和程度的关键因素。一些显微镜聚光镜可以在聚光镜顶部透镜和物镜前透镜之间使用或不使用浸没介质。更常见的是,更高质量的聚光镜被设计用于特定的浸没介质,具有特定的折射率和色散。介质(可以是油、甘油、水或空气)填充聚光镜顶部透镜元件和载玻片下表面之间的空间。

大多数暗场和一些相位对比、微分干涉对比 (DIC) 和偏振光光学系统需要将聚光镜浸入水中,以实现高聚光镜数值孔径。当使用具有定义的折射率和色散的正确浸没介质时,聚光镜的设计可实现最佳性能和最小像差。浸没消除了超过临界角的光损失,消除了额外的折射,最大限度地减少了光的反射损失,并减少了可以在高入射角散射或反射光的光学界面的数量。这种散射和反射成为耀斑源,也改变了偏振光的状态,从而减少了高数值孔径偏振光学系统的消光。总之,聚光镜的浸入会影响现场照度以及图像质量。为达到最佳性能,设计为浸入式的冷凝器应浸入正确的介质中。

虽然视场的照度随着聚光器数值孔径的平方而上升,但是将聚光器可变光阑打开太远超出匹配的物镜数值孔径会产生眩光。此外,错过物镜孔径的照明部分会产生叠加在明场图像上的暗场图像,从而降低图像对比度。

结论

如上所述,光学显微镜中视频传感器或摄影胶片平面上的曝光面积与放大倍率的平方成正比。因此,图像亮度随放大倍数的平方而降低。通常,显微镜用于暴露标本中的精细细节,但同时,显微镜也是一种强大的聚光仪器。正如望远镜或双筒望远镜可以改善我们在夜间的视力一样,显微镜的聚光能力可以有效地用于捕捉微弱照明物体的图像。

根据必须可视化的样本特征,如果收集更多光而不是提高放大倍率,图像可能会变得更有意义。对于许多发光和荧光样本,光照水平可能非常低,以至于高度放大的图像变得不可见或不可检测,因此完全没有意义。在这种情况下,可以通过随时间积分光(如果标本是静态的)或通过降低图像的放大倍率来收集更多的光,从而使图像更易于理解。

对于极低光水平的情况,可以通过使用最高的数值孔径物镜以最低的整体放大倍率来最大化图像亮度。在某些情况下,使用目镜来减少而不是增加中间图像的放大率甚至是有益的。

为了使传感器分辨率与物镜的分辨率相匹配,普遍倾向于提高投射到 CCD 传感器或视频拾取设备上的图像的放大率。由于图像亮度按放大率的平方下降,并且传感器只能在有限的强度范围内工作,因此增加放大率会导致亮度水平下降到传感器的灵敏度以下。如果样品是静止的或变化非常缓慢,则可以通过在多个帧时间内对图像进行积分来显着提高信噪比,或者通过对信号求和或平均,或者更好的是,通过在传感器本身中集成光电子。在这种情况下,牺牲时间分辨率来改善空间信息。无论如何,经常有一场拔河比赛,和妥协,在尝试提高分辨率和尝试降低噪音水平之间,随着图像变得更暗,噪音水平急剧上升。当图像的亮度有限时,显微镜师必须仔细微调仪器放大倍率以达到最佳平衡。