暗场显微镜的暗场照明

2022-02-22 10:06:31 admin 16

我们所有人都非常熟悉黑夜中恒星的外观和可见度,尽管它们与地球相距甚远。星星在晚上很容易被观察到,主要是因为它们微弱的光线和黑色的天空形成了鲜明的对比。

然而,星星在白天和黑夜都在发光,但它们在白天是不可见的,因为太阳的压倒性亮度“遮蔽”了来自星星的微弱光线,使它们变得不可见。在日全食期间,月球在地球和太阳之间移动,挡住了太阳光,即使是白天,现在也可以看到星星。简而言之,在黑暗的背景下,微弱的星光的能见度大大增强。

该原理应用于暗场(也称为暗场显微镜,这是一种简单且流行的方法,可以使未染色的透明标本清晰可见。此类物体的折射率通常与周围环境的折射率非常接近,并且难以在常规明场显微镜中成像。例如,许多小型水生生物的折射率在 1.2 到 1.4 之间,因此与周围水介质的光学差异可以忽略不计。这些是暗场照明的理想候选者。

暗场照明需要阻挡通常穿过和围绕(环绕)样品的中心光,只允许来自每个方位角的倾斜光线“照射”安装在显微镜载玻片上的样品。简单的阿贝暗场聚光镜的顶部透镜是球面凹面的,允许光线从表面以所有方位角射出,形成一个倒置的空心光锥,其顶点位于样品平面的中心。如果没有样品,并且聚光镜的数值孔径大于物镜的数值孔径,则倾斜的光线会交叉,所有这些光线都会因为它们的倾斜而错过进入物镜。视野会变暗。

暗场聚光镜中的样品成像

探索样本如何反射、折射和衍射从暗场聚光镜产生的空心锥体发出的光。

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图 1 中所示的暗场聚光镜/物镜对是一种高数值孔径排列,代表了最复杂配置的暗场显微镜,这将在下面详细讨论。物镜包含一个内部可变光阑,用于将物镜的数值孔径降低到低于聚光镜发射的倒置空心光锥的数值。心形聚光镜是一种反射暗场设计,依靠内部镜子将无像差的光锥投射到样品平面上。

当样品被放置在载玻片上时,尤其是未染色、不吸光的样品,倾斜光线穿过样品并被光学不连续性(例如细胞膜、细胞核和内部细胞器)衍射、反射和/或折射) 允许这些微弱的光线进入物镜。然后可以在黑色背景上看到样本很亮。就傅里叶光学而言,暗场照明从物镜后焦平面处形成的衍射图案中去除了零级(未散射光)。这导致仅由样品散射的高阶衍射强度形成的图像。

图 2 中的显微照片说明了暗场和明场照明对整个装载样本中小型海洋原生动物(放射虫)的二氧化硅骨架的影响。在普通明场中,放射虫的骨骼特征没有很好地定义,并且在用传统胶片记录或数字捕获的显微照片中往往会被洗掉。图 2(a) 中的显微照片是在明场照明下拍摄的,其中聚光孔径光阑接近衍射伪影掩盖一些样品细节的点。这以图像失真为代价来增强样本对比度。在暗场照明(图 2(b))下,出现了更多细节,尤其是在生物体的上部,并且图像获得了明显的 3D 外观。

具有光滑反射表面的样品产生图像的部分原因是光反射到物镜中。在折射率与周围介质不同或出现折射率梯度的情况下(如在膜的边缘),光会被样品折射。反射和折射的两种情况都会在光的方向上产生相对较小的角度变化,从而允许一些进入物镜。相反,一些照射到样品上的光也会发生衍射,产生穿过物镜的整个数值孔径范围的 180 度弧光。物镜在暗场照明下的分辨能力与在明场条件下观察到的相同,但图像的光学特性并没有那么忠实地再现(除非使用专门设计的可变光圈来降低有效数值孔径专为暗场显微镜设计的放大油浸物镜)。

与上述星光的例子一样,明亮的样本和黑暗的环境之间的对比大大提高了可见度。如上所述,在暗场照明中发生的情况是所有通常不偏离的零级光线都被不透明光阑阻挡。斜射线,现在被样品衍射并在物镜的后焦平面产生第一、第二和更高的衍射级,进入图像平面,在那里它们相互干涉以产生样品的图像。

暗场照明的理想候选者包括微小的活水生生物、硅藻、小昆虫、骨头、纤维、头发、未染色的细菌、酵母、组织培养中的细胞和原生动物。非生物样品包括矿物和化学晶体、胶体颗粒、粉尘计数样品,以及含有小夹杂物、孔隙率差异或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片。为暗场显微镜准备标本时应小心,因为位于焦平面上方和下方的特征也会散射光并导致图像退化。标本厚度和显微镜载玻片厚度也非常重要,一般来说,需要薄标本以消除可能干扰图像形成的衍射伪影的可能性。

图 3 所示的台下聚光镜展示了不透明光阑对通过简单折射聚光镜的光路的影响。左侧(图 3(a))是一个典型的阿贝明场聚光镜,孔径光阑打开以最大化光锥的数值孔径。来自光源的光通过孔径光阑,然后通过几个透镜元件折射,形成数值孔径约为 1.20 的倒锥形光。当在完全打开的孔径光阑下方插入一个不透明的蜘蛛式光阑(图3(b))时,中心光线被阻挡,只允许外围光线通过透镜,形成倒斜空心锥光数值孔径(1.20)没有变化。照明空心光锥是由光在透镜元件周边折射形成的,光学校正通常最差。即便如此,这款聚光镜在使用低倍率物镜时仍能充分发挥作用,并为定性暗场工作产生非常好的结果。对于更精确的定量显微镜,有必要使用消球差聚光镜(针对色差和球面像差进行校正),通过产生具有更清晰细节和更可靠特征的图像,其性能要好得多。

在暗场显微镜中,如果你通过伯特兰透镜或相位望远镜观察物镜的背面,它会显得充满光。这种微弱的衍射光在目镜光阑的平面上重构为可见图像,其对比度反转,黑色背景上的明亮图像。由于暗场显微镜消除了明亮的不偏向光,这种照明形式非常浪费光,因此需要高强度的照明源。显微镜载玻片必须具有适当的厚度,大约 1 毫米 +/- 0.1 毫米。样品载玻片和光路中的所有光学表面必须严格清洁,因为每一个污点都会无情地明亮。

阿贝暗场聚光镜

了解改变不透明光阑尺寸如何影响简单阿贝聚光镜中的光锥形成和数值孔径。

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有几种设备用于产生暗场照明。最简单的是放置在台下聚光镜底部透镜(前焦平面)下方的“蜘蛛光阑”(图 3(b) 和 4(a))。孔径光阑和视场光阑都打开得很宽以通过倾斜光线。中央不透明挡板(您可以通过将硬币安装在透明玻璃盘上来制作)挡住了中央光线。该设备运行良好,即使使用阿贝聚光镜(图 3),10 倍物镜高达 40 倍或更高的物镜,其数值孔径不高于 0.65。对于数值孔径为 0.25 的 10 倍物镜,不透明光阑的直径应约为 16-18 毫米,对于数值孔径接近 0.65 的 20 倍和 40 倍物镜,不透明光阑的直径应约为 20-24 毫米。

图 4(a) 中所示的一组光阑尺寸从 8 毫米到 30 毫米不等,为几乎任何数值孔径物镜(低于 0.65)提供出色的暗场不透明光阑。只需卸下支撑架底部的螺丝并用新尺寸更换挡块,即可更换单个挡块。星形支架的外部尺寸将根据冷凝器底部的外壳开口直径而有所不同。

图 4(b) 中所示的光阑是一种巧妙的装置,它使用杠杆控制臂扩展和收缩“反向虹膜”隔膜以增加或减小光阑的尺寸。随着这个杠杆的转动,中央叶片的直径从大约 10 毫米变为 25 毫米,为更高放大倍率的物镜创造了一个更大的光圈。这种类型的可变光阑光圈消除了每次将更高功率的物镜插入光路时更改光阑的需要。它还具有额外的优势,即在观察样本时,对于实现最佳性能所必需的光阑直径的微小差异是“可调的”。尽管这些类型的光圈光阑现在非常罕见,


高倍率的暗场显微镜

对于更精确的工作和更黑的背景,您可以选择专为暗场设计的聚光镜,即仅传输倾斜光线。有几种类型:“干式”暗场聚光镜,在聚光镜顶部和载玻片底部之间有空气 - 以及需要使用一滴浸油(有些设计使用水代替)的浸入式暗场聚光镜冷凝器顶部和载玻片底部之间的接触。浸入式暗场聚光镜具有内部镜面,可通过大倾角且无色差的光线,产生最佳效果和最黑的背景。

可能最广泛使用的暗场聚光镜是抛物面,它由一块非常精确地研磨成抛物面形状的实心玻璃组成,如图 5(b) 所示。入射到抛物面聚光镜的反射表面(图 5(b) 中的玻璃和聚光镜外壳之间)的光将聚焦在反射镜的焦点上。大多数抛物面聚光镜都被切割,以确保焦点稍微超出聚光镜的顶部,这样平行光线将聚焦在最大化样品照明的位置。玻璃聚光镜底部的光阑用于阻挡中心光线到达样品。由聚光镜反射的光线的角度高于反射的临界角,并在聚光镜的主焦点处会聚。

如上所述,干式暗场聚光镜适用于数值孔径低于 0.75 的物镜(图 5(a)),而抛物面和心形浸没聚光镜(图 1 和 5(b))可用于数值孔径非常高的物镜光圈(高达 1.4)。数值孔径高于 1.2 的物镜将需要降低其工作孔径,因为它们的最大数值孔径可能超过聚光镜的数值孔径,从而允许直射光进入物镜。出于这个原因,许多设计用于暗场和明场照明的高数值孔径物镜都采用内置可调节可变光圈作为孔径光阑。数值孔径的这种降低也限制了物镜的分辨率以及图像中的光强度。专为暗场工作设计的专用物镜的最大数值孔径接近暗场聚光镜数值孔径的下限。它们没有内部可变光圈,但镜头安装直径经过调整,因此至少有一个内部镜头具有最佳直径,可用作孔径光阑。

表 2 列出了最常见的反射高数值孔径暗场聚光镜的几个特性。在选择用于高数值孔径暗场应用的聚光镜/物镜组合时,应将此表用作指南。

高数值孔径暗场聚光镜规格

冷凝器型中空集成光圈物镜目的最大数值孔径反射尺度光校正抛光器抛物线1.00-1.40 0.85 1抛物线无光瘤心肌1.20-1.30 1.05 1球形1甲状腺炎 - 3.05 1 CAMPENTRIC 1.20-1.30 1.05 1 CAMPENIDAL1球形BISPHERIC 1.20-1.30 1.05 2球形APLANATIC CASEGRAIN 1.40-1.50 1.30 1 Aspheric1 Spherical Aplanatic Spot Ring(双中心) 1.40-1.50 1.30 2 Spherical Aplanatic NelsonCassegrain 1.30-1.45 1.20 1 Aspheric1 Spherical Aplanatic

冷凝器类型空心圆锥数值孔径物镜最大数值孔径反射面数光学校正
抛物面1.00-1.400.851 抛物线消色差
心形1.20-1.301.051 球形
1 心形
消色差/消
球差
双中心1.20-1.301.051 心形
1 球形
消球差
双球1.20-1.301.052 球形消球差
卡塞格林1.40-1.501.301 个非球面
1 个球面
消球差
点环(双中心)1.40-1.501.302 球形消球差
纳尔逊卡塞格林1.30-1.451.201 个非球面
1 个球面
消球差
表 2

图 5 中所示的聚光镜专门设计用于产生用于暗场照明的高数值孔径的倾斜空心光锥。在这两种情况下,聚光镜的上表面都是平面的并且垂直于显微镜的光轴。左侧的聚光镜(图 5(a))设计用于“干燥”,聚光镜和显微镜载玻片底面之间没有油。相比之下,图 5(b) 中的抛物面聚光镜旨在“涂油”” 到显微镜载玻片的底部,直接在样品下方。使用此聚光镜(或表 2 中列出的任何其他聚光镜)时省略浸油将阻止任何光线到达样品。光线的倾斜空心锥这些聚光镜射出的光不能在没有油的情况下从顶部透镜射出,会被全反射回聚光镜中。倾角比光从玻璃到空气的通过时发生全反射的临界角(大约 41 度)更大。在涂油抛物面聚光镜(图 5(b) 和表 2 中的聚光镜)的情况下,聚光镜玻璃、浸油和载玻片的折射率相等,从聚光镜发出的光穿过试样,不被玻璃-空气接口。

空心光锥数值孔径

使用本教程可视化在反射暗场聚光镜中光的空心锥如何随数值孔径变化。

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表 2 中列出的反射高数值孔径聚光镜涵盖了用于产生高倍暗场显微镜所需的倾斜空心锥光的各种设计。抛物面暗场聚光镜已在上面详细讨论过。另一个非常有用的设计是心形聚光镜,如图 1 所示。这种聚光镜设计利用聚光镜中心的一个镜面半球,作为光阑和反射器,将光引导到形状类似于旋转的心形,电容由此得名。球面和心形反射面的组合产生了一个没有彗差、球面和色差的聚光镜。使用这种高数值孔径的聚光镜有几个技术缺陷。心形聚光镜对对准非常敏感,必须仔细定位以利用非常锐利的照明锥,使其成为最难使用的暗场聚光镜。此外,即使是最微小的灰尘颗粒,聚光镜也会产生大量眩光,而短焦距可能会导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明不佳。在为定量高倍暗场显微镜选择显微镜载玻片时,一定要选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。使其成为最难使用的暗场聚光镜。此外,即使是最微小的灰尘颗粒,聚光镜也会产生大量眩光,而短焦距可能会导致尺寸或厚度超过几微米的物体的照明不佳。在为定量高倍暗场显微镜选择显微镜载玻片时,一定要选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。使其成为最难使用的暗场聚光镜。此外,即使是最微小的灰尘颗粒,聚光镜也会产生大量眩光,而短焦距可能会导致尺寸或厚度超过几微米的物体照明不佳。在为定量高倍暗场显微镜选择显微镜载玻片时,一定要选择由不含荧光杂质的玻璃混合物制成的载玻片。

具有暗场照明的高数值孔径反射聚光镜(图 1、5、6 和表 2)为观察和拍摄极小颗粒或胶体悬浮液的集合提供了选择方法,即使颗粒直径明显低于分辨率极限为目标。这是由于粒子衍射的光穿过物镜并变成可见的明亮衍射盘。如果相邻粒子之间的横向距离大于物镜的分辨能力极限,则每个粒子都可以作为一个微小的衍射盘可见。随着照明强度的增加,微小的衍射粒子与其背景之间的光学差异也会增加。同时地,更小的颗粒(仅通过其散射光的能力可检测到)现在衍射足够的光以变为可见并且即使当它们的直径小于 40 纳米时也可以看到悬浮颗粒,这大约是油浸时 200 纳米分辨率极限的五分之一最高数值孔径的物镜。在生物学应用中,可以使用高数值孔径暗场聚光镜观察和拍摄平均直径约 20 纳米(在明场或 DIC 照明中无法看到)的活细菌鞭毛的运动。这大约是最高数值孔径的油浸物镜的 200 纳米分辨率极限的五分之一。在生物学应用中,可以使用高数值孔径暗场聚光镜观察和拍摄平均直径约 20 纳米(在明场或 DIC 照明中无法看到)的活细菌鞭毛的运动。这大约是最高数值孔径的油浸物镜的 200 纳米分辨率极限的五分之一。在生物学应用中,可以使用高数值孔径暗场聚光镜观察和拍摄平均直径约 20 纳米(在明场或 DIC 照明中无法看到)的活细菌鞭毛的运动。

应注意将高数值孔径聚光镜涂油到样品载玻片底部的细节。很难避免将微小气泡引入聚光镜顶部透镜和显微镜载玻片底部之间的区域,并且应该将这种技术练习到完美。气泡会导致图像眩光和失真,导致对比度损失和整体图像质量下降。使用太厚或太薄的显微镜载玻片时也会遇到问题。许多暗场聚光镜包含直接刻在聚光镜支架上的可用载玻片厚度范围。如果载玻片太厚,如果不使用更高粘度的浸油,通常很难聚焦聚光镜。另一方面,太薄的载玻片容易破坏冷凝器和载玻片之间的油键。购买正确厚度的精密显微镜载玻片以避免上述任何问题是个好主意。

暗场聚光镜调整

探索暗场聚光镜的校准和配置如何影响图像质量。

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当使用高数值孔径暗场聚光镜对浸入水介质中的样品进行成像时,会出现一种独特的情况。在这些条件下,水溶液的折射率限制了光可以从玻璃显微镜载玻片 ( n = 1.515) 进入样品周围的水 ( n = 1.336) 的倾斜角。从玻璃到水的光的最大数值孔径由下式给出:

NA(照度)= 1.555 × sin (i) = 1.336 × sin (90°)

因为sin(90°) = 1

NA(照度)= 1.336

尽管为油浸设计的反射暗场聚光镜列出了数值孔径上限高达 1.50(见表 2),但有助于在水性介质中照亮样品的光的数值孔径必须不大于 1.336,从而降低了有效暗场照明的上限。在样品浸入折射率较高的液体中的情况下,暗场照明的数值孔径的有效上限可以接近最大值 1.50,尽管这在实践中很难实现。

高数值孔径聚光镜,无论是用于干式还是油性,都必须在显微镜的光路中准确居中,以实现最佳性能。为了实现这一点,许多暗场聚光器都在上表面刻有一个小圆圈,以帮助聚光器居中。使用低功率 (10x-20x) 物镜进行定心,方法是对雕刻的圆进行成像并使用聚光镜定心螺钉确保圆(和聚光镜)在光路中正确居中。有关暗场照明显微镜校准的更多详细信息,请参阅显微镜入门中其他地方的暗场显微镜配置部分。

一般来说,在适当的暗场照明条件下成像的物体看起来非常壮观(例如,在暗场中尝试一滴新鲜血液)。通常在明场显微镜中包含非常低的固有对比度的标本在暗场中闪耀。这种照明最适合显示轮廓、边缘、边界和折射率梯度。不幸的是,暗场照明在揭示内部细节方面不太有用。

其他类型的标本,包括许多染色的标本,在暗场条件下也对照明反应良好。图 7 显示了三种类型样本的暗场显微照片,所有这些样本在明场和暗场照明中都产生了良好的对比度。图 7(a) 中所示的鹿蜱 ( Ixodes demmini ) 身体的细节可以在明场中被洗掉,除非聚光镜孔径被缩小以最大化对比度。然而,在暗场中,蜱中的大部分标本细节变得可见,并且可以很容易地在胶片上捕捉到。重度染色的蠕虫吸虫(Echinostoma revolutum,图 7(b)) 在暗场条件下照明时也显示出相当多的细节,图 7(c) 中所示的蚕气管和气门也是如此。除了上述示例之外,还可以在明场和暗场照明下查看和拍摄许多其他标本,以达到所需的效果。

在 20 世纪上半叶,暗场显微镜拥有非常强大的追随者,并且在优化暗场聚光镜和照明器方面付出了很多努力。随着相衬、微分干涉对比和奥林巴斯浮雕对比等更先进的对比度增强技术的出现,这种强烈的兴趣开始逐渐消退。

暗场显微镜仍然是生物学和医学研究的绝佳工具。它可以有效地用于在高倍率下拍摄活细菌,或在低倍率下查看和拍摄细胞、组织和整个支架。海洋生物学家继续使用低功率暗场照明来观察和记录有关藻类和浮游生物等淡水和咸水生物的数据。