显微镜油镜(油浸物镜)的使用方法和注意事项

2021-12-21 09:26:04 admin 9

油镜物镜在显微镜的使用中是很常见的,对于高倍物镜的使用尤为重要。

显微镜物镜捕获来自样品的偏离光线的能力取决于数值孔径和光线穿过的介质。

数值孔径通过等式与成像介质相关:

数值孔径NA ) = n (sin µ)

其中µ是物镜孔径角的二分之一,n是物镜前透镜和样品盖玻片之间介质的折射率。

从上面的数值孔径方程可以明显看出,物镜的数值孔径与盖玻片和前透镜之间成像介质的折射率 ( n ) 以及盖玻片角孔径二分之一的 sin成正比。客观的。由于 sin µ不能大于 90 度,因此最大可能的数值孔径由浸没介质的折射率决定。大多数显微镜物镜使用空气作为介质,光线必须通过空气在保护样品的盖玻片和物镜前透镜之间通过。这种类型的目标被称为物镜,因为它们不使用液体成像介质。空气的折射率为 1.0003,非常接近真空的折射率,远低于大多数液体,包括水 ( n = 1.33)、甘油 ( n = 1.470) 和常见的显微镜浸油(平均n = 1.515)。在实践中,干物镜系统的最大数值孔径限制为 0.95,只有使用专为浸没介质设计的光学器件才能获得更大的数值。

浸油和数值孔径

研究成像介质的折射率如何影响数值孔径。

入门教程

油浸原理如图 1 所示,其中单个光线穿过样品,然后进入物镜或在其他方向折射。图 1(a) 说明了具有 5 条光线(标记为 1 到 5)的干物镜穿过覆盖有盖玻片的样品的情况。这些光线在盖玻片-空气界面发生折射,只有最靠近显微镜光轴的两条光线(光线 1 和 2)具有合适的角度才能进入物镜前透镜。第三条光线与盖玻片成 30 度角折射,不进入物镜。最后两条光线(4 和 5)通过盖玻片从内部反射回来,与第三条光线一起,导致玻璃表面光的内部反射,从而降低图像分辨率。当空气被折射率与玻璃相同的油代替时,如图 1(b) 所示,光线现在直接穿过玻璃-油界面,不会因折射而产生偏差。数值孔径因此增加了n,油的折射率。可以通过有关浸油和数值孔径的交互式 Java 教程来探索这种现象

设计用于浸油的显微镜物镜与那些干燥使用的物镜相比具有许多优点。浸没物镜通常具有更高的校正(萤石或复消色差),当与具有适当分散和粘度的浸油一起使用时,工作数值孔径可达 1.40。这些物镜允许台下聚光器膜片打开到更大的程度,从而扩展样品的照明并利用增加的数值孔径。

在使用增加数值孔径的油浸物镜时,一个经常被忽视的因素是台下冷凝器对系统的限制。在的油目标的情况NA = 1.40被用于图像的样本具有更小的数值孔径的一个台下聚光(1.0例如),冷凝器覆盖的目标和总的说的下数值孔径NA的系统限制为 1.0,即聚光器的数值孔径。

现代台下聚光镜通常具有高度校正(参见我们的聚光镜部分),数值孔径值范围在 1.0 和 1.40 之间。为了有效地利用油浸的所有好处,台下聚光镜前透镜和装有标本的显微镜载玻片下侧之间的界面也应浸入油中。一个理想的系统如图 2 所示,其中浸油已放置在物镜前透镜和载玻片之间的界面以及聚光镜的前透镜和载玻片下侧之间。

该系统被称为均质浸没系统,是在光学显微镜中实现最大数值孔径和分辨率的理想情况。在这种情况下,物镜前透镜、浸油、台下聚光前透镜和安装介质的折射率和色散相等或非常接近相等。在这个理想的系统中,斜光线可以穿过聚光镜并完全穿过显微镜载玻片、浸油和封固剂,在油-玻璃或封固剂与玻璃界面处不会因折射而偏离。

当使用高倍消色差油浸物镜时,有时允许省略给聚光镜顶部透镜上油的步骤。这是因为聚光镜孔径光阑通常必须使用校正较少的物镜来减小,以消除伪影并提供最佳成像。光圈尺寸的减小会降低数值孔径的潜在增加(通过给聚光镜上油提供),因此在这些条件下图像质量的损失通常可以忽略不计。

有多种市售合成油旨在优化浸入式显微镜技术。许多国家/地区已经发布了自己的关于浸油必要质量的标准,并且国际标准化组织已经认可了通用浸油的 ISO 8036 标准光学特性:

  • e = 1.5180 ± 0.0005 ( n D = 1.515)

  • e = 44 ± 3(阿贝数 - 色散的量度)

  • 温度 = 23 ± 0.1 摄氏度

除了严格控制光学性能外,浸油还必须表现出合适的物理化学特性,例如不干燥、对光学表面涂层呈惰性、不发荧光、化学惰性、无毒和易于去除。大多数显微镜制造商为其物镜提供专门的浸油,该油与物镜的分散特性特别匹配。确保您购买的任何售后油都符合与油的预期目标相匹配的分散标准。许多较旧的商业生产的浸油(尤其是 10 多年前生产的浸油)含有大量多氯联苯。这些油是致癌的,应该避免,然而,大多数较新的浸油都不含这种危险化学品,使用起来非常安全。浸入式介质的主要制造商是位于新泽西州 Cedar Grove 的 Cargille Laboratories, Inc.,该公司生产五种标准类型的油:

  • 普通光学显微镜- 满足两种粘度要求(A 型和 B 型的最常见的浸油:150 和 1250 厘沲。这些油可以混合以产生中等粘度。

  • 高粘度油(NVH 型) - 粘度为 21,000 厘沲,这种油适用于倒置、水平和倾斜应用,也适用于使用宽聚光镜间隙的超长工作距离物镜和样品。

  • 荧光显微镜(DF 型) - 一种油,可在荧光显微镜下产生最高分辨率。这种油产生浅绿色的背景颜色。

  • 荧光显微镜(FF 型) - 改进的油,基本上没有背景荧光,晶莹剔透且不吸水。这种油通常被称为“通用”油,因为它几乎可以替代任何其他用于荧光应用的浸油。

表 1 列出了三种最常见的 Cargille Laboratories 浸油的特性。

嘉吉浸油
财产A型
B型
类型 NVH
F
(氢 F 线)
1.52361.52361.5227
C
(氢 C 线)
1.51151.51151.5118
D
(钠 D 线)
1.51501.51501.5150
e
(非凡)
1.51801.51801.5176
平均色散 ( F - n C )0.01210.01210.0109
阿贝数
D )
42.642.647.2
温度系数
-d n /d t )
0.000330.000330.00031
荧光(紫外线)非常低低的低的
粘度
(cSt 或 mm 2 /s)
150(低)1250(高)2100
(诉高)
表格1

普通浸油的一个主要问题是它们在光谱的紫外区域(低于约 375 纳米)固有的高吸收特性。这不会影响使用浸没介质完成的大部分可见光光学显微镜检查,但在尝试对波长低于 400 纳米的样本进行成像时可能会导致麻烦。甘油的紫外吸收在 400-350 纳米范围内可以忽略不计,因此纯溶剂或与水 90:10 的混合物可用于具有近紫外显微镜的浸没技术。

红外 (IR) 显微镜也因浸没材料在超过 700 纳米波长处的吸收而产生伪影。红外显微镜唯一实用的介质是石蜡油,它也可用于荧光浸没显微镜,因为它在低至 350 纳米的波长下具有可忽略不计的荧光。

表 2 中列出的浸没介质具有广泛的折射率,可用于各种不同的光学显微镜技术。大多数折射率等于或低于玻璃的介质用于常见的生物明场、相差、DIC和荧光显微镜那些具有非常高折射率的介质,例如溴萘和亚甲基碘,与专门的物镜一起使用以实现尽可能高的数值孔径和分辨率,并且对于反射率非常低或变化的材料的反射光显微镜也非常有用。

常见的沉浸式媒体
材料折光率
空气1.0003
1.333
甘油1.4695
石蜡油1.480
雪松油1.515
合成油1.515
苯甲醚1.5178
溴萘1.6585
亚甲基碘1.740
表 2

组织和细胞培养技术的现代进步激发了人们对能够对浸泡在生理盐水溶液中的活细胞和组织进行成像的兴趣。目前正在使用定量光学成像技术(包括共聚焦、微分干涉对比 (DIC) 和落射荧光显微镜)对活组织内的细胞动力学进行深入研究。活细胞的平均折射率为 1.35,非常接近周围缓冲盐水溶液的折射率 ( n= 1.33) 必须存在以支持正在进行的细胞活动。当使用长工作距离干物镜来可视化水性组织培养中的细胞时,会出现一个问题,因为液体表面的反射会掩盖样本的细节。同样,由于水性成像介质和物镜前透镜的玻璃之间的折射率差异,使用油浸物镜观察活细胞也存在问题。

图 3 中所示的目标旨在用于对缓冲盐水溶液中的细胞和组织进行成像,同时在观察过程中为样品的显微操作提供足够的空间。容纳物镜前透镜元件的鼻子(或倾角锥)以 43 度角逐渐变细,以允许陡峭的方法倾斜,从而使操纵器或微电极易于接近样品,同时保持样品和物镜浸入解决方案。这些物镜还具有从 2.0 毫米(60 倍平面萤石)到 3.3 毫米(10x - 40 倍平面萤石)的长工作距离,这也有助于为样品的显微操作留出额外的空间。这一系列物镜中的数值孔径与典型的干平萤石中的数值孔径相当(通常略高)。Olympus Zeiss LeicaNikon以及制造商通常提供额外的附件,可用于组织培养样品和其他生物样品的显微操作。

图 4 说明了通过观察组织培养中的活大鼠提睾肌,可以很好地展示分辨率和增强细节的水浸物镜。

图 4(a) 是使用位于空气/水界面正上方的正常干燥 4x 物镜拍摄的大鼠组织的显微照片。请注意由于水面反射而导致的样本失真和模糊。这些影响在图 4(b) 中被消除,这是相同视场的显微照片,但使用 4x 水浸物镜。该图像比干物镜提供的图像清晰得多,并显示出更高的精细细节分辨率。

成像组织样本的另一个问题是在高放大倍数下检查样本时,油浸物镜显示的分辨率和照明强度范围有限。当样品被盖玻片覆盖并浸泡在水溶液中时,浸入式物镜通常会在样品中超过 10 微米的深度失去其出色的成像特性。图 5(a) 说明了这个问题,其中光线追踪表明,当使用油浸物镜通过n = 1.515 的浸油对样品进行成像时,水介质中的球体变形为明显拉长的椭圆形

使用水浸物镜时,相同的球体仍保持球形,即使成像光线仍必须通过折射率等于 1.515 的玻璃盖玻片。水浸物镜还消除了通过水溶液观察样品时经常产生的球面像差。这些先进的物镜还具有更高的轴向分辨率,通常等于数值孔径的理论极限,它们产生出色的对比度和分辨率,并提供更高的照明强度。

油浸显微镜技术提示

显微镜的第一条规则是保持光学元件完全没有灰尘、污垢、油、溶剂和任何其他污染物。显微镜应保存在尽可能干净且对循环空气干扰最小的低振动无烟房间内。不使用时,请在显微镜上盖上防尘罩,并将所有配件保存在密封容器中。避免使用腐蚀性溶剂清洁显微镜的任何部分,仅使用稀释的肥皂水清洁非光学表面。使用油时应牢记以下技术和注意事项:

  • 第一步是用低倍物镜定位样品并放置显微镜载玻片,使感兴趣的区域正好位于载物台开口的中央部分。通常需要将浸入式物镜(无油)旋转到位,以确保样品的正确位置。为了在使用油浸技术时获得最佳效果,重要的是还要将油涂抹在显微镜载玻片的下侧和台下聚光镜的顶部透镜上,以在两者之间形成油珠,如下所述。大多数现代显微镜在机械载物台上提供了一个相对较宽的椭圆形开口,以允许在显微镜载玻片底部和聚光镜前透镜之间的区域使用油。

  • 将浸入式物镜摆动到物镜转盘中的某个位置,在那里它将成为下一个旋转到样品正上方光路中的物镜。使用一张无绒纸或滴管将一小滴油直接滴在浸没物镜的前透镜上。接下来,将另一滴油滴在要成像的区域正上方的盖玻片上。奥林巴斯尼康制造的许多新型油浸物镜在其浸没物镜中使用平凹前透镜,并且这些物镜不能省略给物镜前透镜上油的步骤。未能填充这些物镜中的凹“腔”可能会导致微小气泡的夹带,从而导致严重的耀斑和图像质量下降。

  • 使用粗调焦旋钮将油目标慢慢降低到显微镜盖玻片上的小油池中。当沾油物镜前透镜与盖玻片上的油液接触时,油液交界处会发出少量的散射光,表明两个油池已经合并。这一步要非常小心,因为将物镜太靠近盖玻片可能会导致两者之间发生碰撞,从而可能导致损坏。

  • 使用粗调使标本慢慢聚焦,直到细节开始变得可见,然后切换到微调,使标本正确聚焦。重要的是要记住,大多数萤石和复消色差物镜的工作距离小于十分之一毫米,导致微调旋钮的调节范围非常窄,因此请仔细监测物镜接近油池的情况。通过粗调或微调降低它。尽管大多数大功率浸油物镜都有弹簧加载的前端,可以缩回到物镜主体中,但不小心使用这些物镜仍可能将物镜推入样品载玻片中,从而造成损坏。

  • 许多显微镜专家使用的另一种方法是使用低倍物镜将要成像的区域定位在显微镜光路的中心。接下来,将油浸物镜(无油)放入光路中,将感兴趣的样品区域大致带入视野中心并聚焦。这预先放置了系统的所有组件,为添加油做准备。将浸入式物镜摆动到显微镜物镜转换器上的相邻挡块上,并将油涂在物镜前透镜和样品上,如上所述。接下来,将上油的物镜快速旋转到样品上方的位置,将两个油滴(一个在样品上,一个在物镜上)合并到一个池中。标本现在已准备好进行观察和显微摄影。

在台下聚光镜的前透镜上涂油时,请注意以下事项:

  • 确保显微镜的机械载物台有一个足够大的开口,以允许扫描上油的样品而不会将油溅到载物台的底部。许多先进的研究显微镜都有一个可拆卸的载物台插件,以便与油一起使用。在将油涂抹到聚光镜顶部透镜之前,从显微镜载物台上取下样品载玻片。

  • 以类似于给物镜上油的方式,在显微镜载玻片的底部滴一滴油,然后在台下聚光镜的前透镜上滴一滴类似的油。在更换载物台上的显微镜载玻片之前,确保冷凝器在其机架中略微降低。将载玻片放置在舞台上后,将聚光镜放回正确位置,同时仔细观察聚光镜和显微镜载玻片上的油滴。当冷凝器进入适当的位置时,这些液滴应该合并成一个。

  • 当您扫描涂油显微镜载玻片的表面时,定期观察载物台相对于物镜和聚光镜前透镜的位置,以确保这些元件和显微镜载玻片之间有连续的油珠。在显微镜载玻片上大面积扫描时,通常需要重新涂抹一些油以确保成像介质的连续性。

保持镜片清洁无油
始终努力确保您的显微镜物镜和台下聚光镜前透镜保持清洁且没有浸油。许多制造商宣传不干燥据报道,浸油具有如此高的蒸气压,以至于溶剂不会蒸发,从而在光学表面上留下结晶残留物。在某些情况下这几乎是正确的,但用昂贵的光学设备赌博是危险的。实验完成后,使用棉签或无绒纸或布轻轻擦去镜片和显微镜载玻片上多余的油。去除油污后,使用合适的溶剂去除镜片上的浸油痕迹。当浸油干燥或从大气中收集灰尘和其他污染颗粒时,未能正确清洁镜片可能会导致在涂层表面上形成小微晶。