显微镜物镜的基本构造

2021-12-16 10:45:18 admin 4

也许多达 90% 的光学显微镜研究是使用标准消色差或平面消色差物镜进行的,这些物镜是最便宜、最容易获得的,并且已经安装在世界各地的大量显微镜上。大多数显微镜制造商还提供各种具有独特配置的物镜,旨在执行普通实验室显微镜通常不具备的特定功能。

针对不同程度的光学像差进行校正的标准明场物镜是最常见的,对于使用传统照明技术(如明场、暗场、斜射和莱茵伯格)检查标本非常有用。其中一些方法涉及对台下聚光镜的修改,但仍然使用标准消色差、萤石和/或复消色差物镜,无论是否带有平场校正。其他更复杂的技术需要特定的物镜配置,通常包括在后焦平面上或附近放置探测器。使问题复杂化的是,物镜后焦平面通常位于内部玻璃透镜元件的中心,显微镜师不易接近该区域。

为相位对比、霍夫曼调制对比和微分干涉对比设计的物镜需要光学探测器的帮助来修改发生在物镜后焦平面的事件。这些物镜必须经过特殊构造,才能将检测元件物理地放置在物镜主体内的适当焦平面上。相差物镜(如下所述)需要在后焦平面插入包含中性密度材料和/或光波延迟器的相位板。此外,相位板必须与位于级下冷凝器中的匹配环圈共轭放置。霍夫曼物镜还需要物镜后焦平面中的调制板,该调制板与聚光镜中的狭缝板共轭。微分干涉对比物镜通常不需要修改(除了使用无应变光学元件),但确实依赖于战略性放置的 Wollaston 或 Nomarski 棱镜的作用,以影响后焦平面处剪切光束之间的光路差异。其他专用物镜依靠改进的光学元件、镜子或斜反射器的插入、可调光圈和/或可移动元件来执行独特的功能。本节的其余部分将讨论有关此类目标的具体要求的详细信息。但确实依赖于战略性放置的 Wollaston 或 Nomarski 棱镜的作用,以影响后焦平面处剪切光束之间的光路差异。其他专用物镜依靠改进的光学元件、镜子或斜反射器的插入、可调光圈和/或可移动元件来执行独特的功能。本节的其余部分将讨论有关此类目标的具体要求的详细信息。但确实依赖于战略性放置的 Wollaston 或 Nomarski 棱镜的作用,以影响后焦平面处剪切光束之间的光路差异。其他专用物镜依靠改进的光学元件、镜子或斜反射器的插入、可调光圈和/或可移动元件来执行独特的功能。本节的其余部分将讨论有关此类目标的具体要求的详细信息。

相衬- 这是一种将对比剂引入半透明、未染色标本(如活组织培养物中的微生物和细胞)的经典方法,过去 50 年生物学家一直采用这种方法。相位对比操纵从样品发出的单个光线之间的相位关系,并将它们转化为显微镜师可见的振幅或亮度变化。需要一个特殊的物镜,该物镜在靠近物镜后焦平面的玻璃上装有一个深色圆环或凹槽(相位板),如图 1 所示。此外,聚光镜还必须用特殊的环形开口进行修改适合特定的放大倍数和物镜。:

  • DL (Dark-Light) - DL 物镜在浅灰色背景上产生深色图像轮廓。这些物镜旨在为折射率差异很大的样品提供最强的暗对比度。DL 相差物镜是检查细胞和其他半透明活体材料最流行的类型,特别适用于显微摄影和数字成像。

  • DLL(暗低对比度) ——与 DL 物镜类似,DLL 系列允许在明场中获得更好的图像,并且通常在利用多种照明模式(如荧光、DIC、明场和暗场)的显微镜系统中用作“通用”物镜。

  • ADL(变迹暗光) - 最近由尼康推出,变迹相衬 ADL 物镜在相位环的两侧包含一个二级中性密度环。添加次级环有助于减少通常与相差显微镜成像相关的不需要的“光晕”效应。

  • DM (Dark-Medium) - DM 物镜在中灰色背景上产生深色图像轮廓。这些物镜设计用于与具有小相位差的样品(例如细纤维、颗粒和颗粒)的高图像对比度。

  • BM (Bright-Medium) - 通常被称为负相衬,BM 物镜在中等灰色背景上产生明亮的图像轮廓。BM 物镜是目视检查细菌鞭毛、纤维蛋白束、微小小球和血细胞计数的理想选择。

为了让显微镜师能够快速识别相衬物镜,许多制造商在外筒上用绿色字母标出了重要的规格,例如放大倍数、数值孔径、管长校正等。这用于区分相衬物镜与普通明场、偏振、DIC 和荧光物镜,后者使用替代颜色代码或标准黑色字母。

微分干扰对比度 (DIC)- Nomarski 微分干涉对比也可用于未染色的样品,但对双折射样品效果较差,可与反射光一起用于金相和晶片检测。DIC 物镜未在内部进行修改,而是设计用于与特殊放大倍率相关的修改 Wollaston 或 Nomarski 棱镜一起使用,以产生高对比度图像。当棱镜从光路中移除时,这些物镜对于明场、暗场和其他技术也很有用。由于 DIC 显微镜使用偏振光,因此必须将专为此类应用设计的物镜中的应变降至最低。过去,只有无应变消色差镜、平面色差镜和一些高性能萤石物镜才适合这项任务。然而,最近镜头设计和抗反射涂层的改进现在允许使用复消色差物镜进行 DIC 观察、显微摄影和数字成像。与 DIC 棱镜一起使用的物镜桶通常刻有旨在与物镜耦合的特定棱镜(低、中、高或 1、2、3 等)。

霍夫曼调制对比度- 霍夫曼调制对比度系统的物镜旨在通过检测光学梯度(或斜率)并将其转换为光强度的变化来提高未染色和活体材料的可见度和对比度。调制对比物镜具有独特的光学幅度空间滤波器,称为调制器,插入到消色差或平面色差物镜的后焦平面(见图 2)中(尽管也可以使用更高的校正因子)。调制器具有三个不同中性密度的区域,可以传输通过物镜的光的 1%、15% 或 100%。与相衬物镜中的相位板不同,霍夫曼调制器的设计不会改变通过任何区域的光的相位。在调制对比度光学系统下观察时,在普通明场显微镜中基本上不可见的透明物体呈现出明显的三维外观,由样品中的相位梯度决定。霍夫曼物镜设计的最新创新产生了允许使用物镜内的调制器改变对比度方向的模型。

红外显微镜- 电磁辐射光谱红外区域的光学显微镜通常用于研究在可见光谱中均匀透明或不透明但在 700 纳米以上波长区域具有明显吸收或透射带的材料。反射光是红外显微镜的首选技术,并且已经设计了几种专门的反射光物镜来捕捉从不透明标本反射的红外光的图像。

尽管所有显微镜物镜都传输一定程度的较短红外波长,但很少有人针对该区域的像差进行校正,并在从可见光到红外光转换时显示出明显的焦点偏移。大多数制造商提供具有减小数值孔径的专用物镜,旨在增加用红外光成像的标本的焦深。油浸物镜无法使用标准油正常工作,目前可用于红外显微镜的唯一合适的浸渍液是石蜡油。这种类型的显微镜主要关注的是使用传统成像技术捕获令人满意的显微照片的能力。目前,有几种可响应红外光谱的胶片乳剂,

干涉显微镜- 干涉测量法通过利用当穿过物体的光与遵循稍微不同路径的参考光束干涉时产生的干涉来应用于微观样品的研究。在这些情况下,当两束光束之间的光程差转换为强度波动时,反射光试样或透明试样的不透明表面就会成像。已经为干涉显微镜实施了各种各样的显微镜和物镜设计,其中许多都遵循了迈克尔逊、马赫-曾德和贾明干涉仪的基本原理。

偏振光- 与大多数其他形式的显微镜不同,当在物镜的构造中使用最少的光学元件时,偏光显微镜可产生最佳图像。重要的是要确保透镜元件、光学胶和抗反射涂层没有应变和双折射材料,这些材料可能会干扰样品双折射的定量评估。复消色差物镜是大多数显微镜形式的选择,通常不用于偏振光研究,因为内部透镜元件的数量很多,通常会导致内部反射和应变。大多数制造商生产的物镜专门针对偏振光和微分干涉对比进行了优化,萤石级物镜最常用于这些目的。

紫外荧光物镜- 落射荧光应用需要高数值孔径的物镜,以便从微弱的荧光样品中捕获最大量的光。在对单分子和其他低光荧光事件进行成像时,特定样本荧光与固有背景荧光的比率成为主要关注点。在这些情况下,目标内部的自发荧光和/或内部反射会干扰对小结构和低荧光目标的成像。

荧光物镜采用石英和特殊玻璃设计,具有从紫外线(低至 340 纳米)到电磁辐射光谱的红外线区域的高透射率。这些物镜的自发荧光极低,以优化附着在标本上的荧光团作为二次荧光发射的光通量。除了特殊的透镜元件外,紫外 (UV) 荧光物镜还使用专门的光学胶和抗反射涂层,这些涂层旨在通过整个光谱范围内的荧光激发范围进行操作。UV 荧光物镜中光学像差和数值孔径值的校正通常接近复消色差仪,这有助于提高这些高级镜头生成的图像的图像亮度和分辨率(图 4)。此外,这些物镜采用非荧光玻璃设计,以最大限度地减少内部透镜元件自发荧光引起的伪影。高性能荧光物镜的主要缺点是许多物镜没有针对场曲进行校正,导致图像在整个视场中没有统一的焦点。尽管在对弱荧光标本进行成像时(尤其是使用激光扫描共聚焦显微镜),这个问题只是次要问题,但当物镜用于在传统照明技术(如明场、暗场和微分干涉对比)下执行时,它成为一个主要问题。这些物镜采用非荧光玻璃设计,以最大限度地减少内部透镜元件自发荧光引起的伪影。高性能荧光物镜的主要缺点是许多物镜没有针对场曲进行校正,导致图像在整个视场中没有统一的焦点。尽管在对弱荧光标本进行成像时(尤其是使用激光扫描共聚焦显微镜),这个问题只是次要问题,但当物镜用于在传统照明技术(如明场、暗场和微分干涉对比)下执行时,它成为一个主要问题。这些物镜采用非荧光玻璃设计,以最大限度地减少内部透镜元件自发荧光引起的伪影。高性能荧光物镜的主要缺点是许多物镜没有针对场曲进行校正,导致图像在整个视场中没有统一的焦点。尽管在对弱荧光标本进行成像时(尤其是使用激光扫描共聚焦显微镜),这个问题只是次要问题,但当物镜用于在传统照明技术(如明场、暗场和微分干涉对比)下执行时,它成为一个主要问题。高性能荧光物镜的主要缺点是许多物镜没有针对场曲进行校正,导致图像在整个视场中没有统一的焦点。尽管在对弱荧光标本进行成像时(尤其是使用激光扫描共聚焦显微镜),这个问题只是次要问题,但当物镜用于在传统照明技术(如明场、暗场和微分干涉对比)下执行时,它成为一个主要问题。高性能荧光物镜的主要缺点是许多物镜没有针对场曲进行校正,导致图像在整个视场中没有统一的焦点。尽管在对弱荧光标本进行成像时(尤其是使用激光扫描共聚焦显微镜),这个问题只是次要问题,但当物镜用于在传统照明技术(如明场、暗场和微分干涉对比)下执行时,它成为一个主要问题。

反射光物镜- 设计用于盖玻片的透射光物镜不适用于检查表面未覆盖的反射光样品。取而代之的是,反射光显微镜采用了专门的物镜,这些物镜在没有盖玻片的情况下对样品的观察和成像进行了校正。今天,大多数反射光显微镜物镜都经过无限远校正,并提供从 5 倍到 200 倍的广泛放大倍率。这些物镜以各种质量的色差和球面校正制造,范围从简单的消色差仪到平差色差仪和平差色差仪。大多数(但不是全部)被设计为“干燥”使用,物镜和样品之间的空间中有空气。许多反射光物镜被设计成聚焦在比通常更长的工作距离(见下文)。这些物镜在物镜的桶上标记为LWD大号W¯¯工作会有d istance),ULWDû ltra-大号W¯¯工作会有d istance),和ELWDË xtra-大号W¯¯工作会有d istance)。

设计用于反射暗场照明的物镜具有特殊结构,包括一个 360 度空心室,围绕着位于中心的透镜元件(图 5)。来自照明器的光穿过物镜的外围,并从斜光线的每个方位角射向样品,形成一个空心的照明锥。这通常是通过位于物镜空腔底部的圆形反射镜或棱镜来实现的。以这种方式,物镜作为两个单独的光学系统同轴耦合,使得外部系统用作“聚光镜”,内部系统用作典型的物镜。

在反射光物镜中,围绕透镜元件的空心环的必要性要求物镜的直径明显大于普通明场物镜的直径。在大多数情况下,反射光物镜使用比皇家显微学会 (RMS) 标准更大的物镜安装螺纹直径。这要求反射光暗场物镜具有更大螺纹尺寸的物镜转换器,通常称为BDBF/DF螺纹尺寸。大多数制造商提供将标准 RMS 螺纹尺寸物镜转换器转换为 BD 螺纹尺寸的物镜适配器,允许在反射光显微镜上使用这些物镜。应注意确保 BD 螺纹物镜转换器上使用的物镜与显微镜的镜筒长度一致。

可变数值孔径物镜- 具有异常高荧光量子产率和/或非常明亮的暗场样品的样品通常会因焦平面外区域发出的光而引起图像眩光。为了补偿这种伪影,制造商提供配备内部可变光阑的高数值孔径物镜,以在显微摄影或数字成像过程中增加图像对比度。打开或关闭虹膜光圈决定了物镜后孔径的大小,产生了一个介于 0.5 和物镜上限之间的可变数值孔径范围(复消色差物镜可达 1.35-1.4;图 6)。尽管虹膜光阑曾经用于各种物镜设计,但现代可变数值孔径物镜通常处于放大倍数范围的高端(60 倍至 150 倍)。

超低放大倍率物镜- 放大倍数低于 4 倍的物镜被认为放大率非常低(见图 7),可能无法与所有显微镜光学系统兼容。通常,使用低倍率物镜很难实现科勒照明,这通常需要专门的匹配聚光镜才能用足够的照明填充后孔。最近已经实现了低至 0.5 倍的放大倍率,但这些物镜需要特殊的管透镜和聚光镜,这使得它们只能在设计它们的显微镜上使用。

长工作距离 (LWD) - 这些物镜的设计目的是通过使用特殊的光学元件来增加传统物镜的工作距离。LWD 目标最有用的应用是通过用于支撑细胞的厚容器壁观察组织培养中的活细胞。这些物镜的其他用途是通过厚玻璃板(例如,在两个显微镜载玻片之间)对样品进行成像,或者当必须在观察时对样品进行显微操作时。还生产具有长工作距离的反射光物镜,用于检查通常体积太大而无法放入普通显微镜光学系统范围内的大型样品。