显微镜UIS2光学系统介绍

2021-12-13 09:58:45 admin 6

在过去的 10 年里,主要的显微镜制造商基本上都转向在研究级生物医学和工业显微镜中使用无限远校正光学系统在这些系统中,像距设置为无限远,并且在物镜和目镜(目镜)之间的镜筒内战略性地放置了一个管(或特兰)透镜以产生中间图像。

无限远光学系统允许将辅助组件(例如微分干涉对比 (DIC) 棱镜、偏振器和落射荧光照明器)引入物镜和管透镜之间的平行光路中,而对聚焦和像差校正的影响很小。较旧的有限或固定管长度的显微镜从物镜筒固定的物镜开口到目镜管中的目镜座之间具有指定的距离。这个距离称为机械管长度显微镜的。该设计假设当样品被放置在焦点上时,它比物镜的前焦平面远几微米。有限管长度在 19 世纪被皇家显微学会 (RMS) 标准化为 160 毫米,并得到了 100 多年的广泛接受。设计用于管长为 160 毫米的显微镜的物镜在镜筒上刻有此值。

在固定管长显微镜的光路中添加光学附件,可将有效管长增加到大于 160 毫米的值。出于这个原因,添加垂直反射光照明器、偏振中间台或类似的附件可以将球面像差引入原本完美校正的光学系统中。在大多数显微镜具有固定镜筒长度的时期,制造商被迫在这些附件中放置额外的光学元件,以重新建立显微镜系统的有效镜筒长度 160 毫米。此操作的代价通常是增加放大倍率并降低生成的图像中的光强度。

一些反射光系统也受到“重影”的阻碍,这种重影是会聚光线穿过分束器的结果。为了规避添加辅助光学元件带来的伪影,德国显微镜制造商 Reichert 率先提出了无限远光学的概念。该公司早在 1930 年代就开始试验无限远校正光学系统,随后是徕卡和蔡司,但这些光学系统直到 1980 年代才成为大多数制造商的标准设备。

无限远校正显微镜中的镜筒长度称为参考焦距,范围在 160 到 200 毫米之间,具体取决于制造商(参见表 1)。无限远系统中光学像差的校正是通过管透镜或物镜完成的。无限远物镜的残余横向色差可以通过仔细的管镜设计轻松补偿,但包括尼康在内的一些制造商选择校正物镜本身的球面像差和色差。这是可能的,因为开发了具有极低色散的专有新玻璃配方。还有其他制造商(特别是蔡司 ICS 系统)在管透镜和物镜中使用校正组合。

无限远光学系统参数
制造商管透镜
焦距
(毫米)
齐焦距离
(毫米)
螺纹类型
徕卡20045M25
尼康20060M25
奥林巴斯18045有效值
蔡司16545有效值
表格1

表 1 中列出了主要制造商提供的无限远校正显微镜的规格,包括管透镜焦距、齐焦距离和物镜螺纹类型。尽管徕卡和尼康都使用 200 毫米的镜筒长度和 25 毫米的物镜螺纹尺寸,但尼康 CFI 60系统的物镜齐焦距离明显更大奥林巴斯和蔡司使用较短的管透镜焦距(分别为 180 和 165 毫米),但两家公司均已标准化物镜螺纹尺寸并坚持 45 毫米的齐焦长度。

在固定管长的有限光学系统中,穿过物镜的光被导向中间像平面(位于目镜的前焦平面)并在该点会聚,经历相长干涉和相消干涉以产生图像(图2(a))。对于无限远校正光学系统,情况完全不同,其中物镜产生在无限远(通常称为无限空间)成像的平行光波列通量图 2(b)),由管透镜在中间像平面聚焦。应该注意的是,为无限远校正显微镜设计的物镜通常不能与用于有限(160 或 170 毫米)光学管长度显微镜的物镜互换,反之亦然。由于缺少管透镜,无限远透镜在有限显微镜系统上使用时会遭受增强的球面像差。然而,在某些情况下,可以在无限远校正显微镜上使用有限物镜,但有一些缺点。当有限物镜与无限远系统一起使用时,它们的数值孔径会受到影响,从而导致分辨率降低。此外,当在同一系统中使用时,有限和无限目标之间会失去齐焦性。

如上所述,无限远系统的基本光学组件是物镜、镜筒透镜和目镜。如图 2(b) 所示,样品位于物镜的前焦平面,它收集从样品中心部分透射或反射的光,并产生沿物镜光轴投射的平行光束。显微镜朝向管透镜。到达物镜的一部分光从样品的外围发出,并以斜角进入光学系统,沿对角线(但仍为平行光束)向着管透镜前进。由管透镜收集的所有光线然后聚焦在中间图像平面上,随后由目镜放大。

物镜和管透镜一起形成一个复合物镜系统,在显微镜管内的有限距离处产生中间图像。在设计无限远校正显微镜时,管透镜相对于物镜的位置是首要考虑的问题。物镜和管透镜之间的区域(无限远空间)提供了一条平行光线的路径,可以将复杂的光学组件放入其中,而不会引入球面像差或修改物镜工作距离。事实上,匹配组中不同物镜之间的齐焦性可以通过无限远校正显微镜保持,即使在光路中添加一个或两个辅助组件时也是如此。另一个主要好处是附件可以设计为产生精确的 1x 放大倍率值,而不会改变物镜和套管透镜之间的对齐方式。此功能允许使用多种光学技术的组合对样本进行比较,例如相衬或 DIC 与荧光(单独或同时)。这是可能的,因为放置在一组平行光波中的光学配件不会移动图像的位置(横向或轴向)或焦点。

如果管透镜非常靠近物镜,则可用于辅助光学组件的空间量是有限的。然而,在现代显微镜设计的限制内,可以位于管透镜和物镜之间的光学组件的数量存在上限。将管透镜放置在离物镜太远的地方会减少透镜收集的外围光波的数量,导致图像边缘变暗或模糊,并降低显微镜的性能。应该强调的是,术语无限远光学是指在穿过物镜后产生平行右光线通量,而不是显微镜内部有无限空间。为了在保持高性能的同时最大限度地提高显微镜配置的灵活性,有必要优化物镜和管镜之间的距离。

无限远校正物镜产生的放大倍率是通过将参考焦距(管长)除以物镜的焦距来计算的。随着管透镜焦距的增加,到中间像平面的距离也增加,从而导致管总长度变长。200 到 250 毫米之间的管长度被认为是最佳的,因为焦距越长,对角光线的离轴角就越小,从而减少系统伪影。更长的管长度还增加了系统在附件组件设计方面的灵活性。

当比较具有 160 毫米和 200 毫米套管透镜焦距的系统时,较长套管透镜焦距的优势变得明显(图 3)。对于较长焦距的光学系统,离轴对角波通量角的减小可以达到相当大的百分比。斜光线角度的减小在通过辅助组件(DIC 棱镜、相位环、分色镜等)的同轴和离轴光线中产生相应较小的偏移,从而提高了显微镜的效率。在无限远校正系统中使用落射荧光照明器观察到的对比度水平的显着增强归因于更长的管透镜焦距的光学优势。图 4 显示了使用无限远光学器件观察到的显微镜图像的改进示例,这说明了用三种荧光染料标记的小鼠肠道薄切片。显微照片是在 Nikon Eclipse E600 上使用 CFI 记录的60 20x 油浸物镜,数值孔径 0.75,同时在微分干涉对比和落射荧光模式下运行。

与旧的固定镜筒长度系统相比,必须使用无限远系统增加物镜焦距以保持相同的放大倍率。多年来,所有显微镜制造商都将 45 毫米的齐焦距用于有限管长度系统,但这对于高性能无限远校正光学系统来说可能是不够的。例如,一个平面复消色差 60x 油浸物镜(性能最好的有限物镜之一)可以有超过 10 个单独的透镜元件和组,从而非常适合限制在 45 毫米齐焦距离的物镜。当被细分为单独的物镜(具有更多光学元件)和管透镜的无限远系统取代时,管透镜的焦距变为大约 150 毫米。为了满足无限远系统的全部光学潜力,物镜齐焦距离必须与管透镜焦距相匹配。因此,对于 200 毫米焦距,最佳齐焦距离为 60 毫米,比旧的标准长度高 15 毫米。

离轴光通量和管长

观察离轴光线的角度如何受具有无限远校正光学系统的管透镜焦距的影响。

入门教程

在无限远光学系统中使用更长的物镜焦距需要相应更大的工作距离来匹配。增加物镜的齐焦距离对于实现工作距离的显着增加至关重要,特别是对于较低放大倍数的物镜。例如,对于 1x 物镜,用于计算无限远校正系统放大率的公式规定物镜焦距应与套管透镜相同。在具有 200 毫米管透镜焦距的系统中,这将需要更长的齐焦距离才能使用这种低倍率的物镜。计算表明,使用 200 毫米管透镜焦距可以获得低至 0.5 倍的放大倍率,

另一个考虑因素是物镜瞳孔直径,在具有长管透镜焦距的光学系统中,为了获得最佳性能,也必须增加物镜瞳孔直径。RMS 标准物镜螺纹尺寸为 20.32 毫米,限制了如此配备的物镜的有效瞳孔直径和最大可达到的数值孔径。为了在使用长管透镜焦距时产生更高的数值孔径,必须增加物镜螺纹尺寸。实现所需数值孔径所需的有效出瞳直径 ( D ) 由以下公式表示

D = 2NA × f

其中NA是数值孔径,f是物镜焦距。因此,对于焦距为 100 毫米(使用 200 毫米焦距管透镜)和数值孔径为 0.10 的 2x 复消色差物镜,必要的出瞳直径 ( D ) 为 20 毫米。显然,在设计无限远光学系统时,较小的物镜螺纹尺寸限制了放大倍数低于 10 倍的物镜数值孔径。将管长度增加到 200 毫米以上需要更大的物镜出瞳尺寸,这使其成为无限远校正显微镜设计的限制因素。