如何进行奥林巴斯DIC 显微镜对准(微分干涉显微镜)

2022-07-26 16:01:19 admin 30

微分干涉对比 ( DIC ) 光学元件几乎可以安装在任何明场透射、反射或倒置显微镜上,前提是该仪器能够接受偏振滤光片和专门设计的聚光镜和物镜棱镜(连同外壳)执行技术。

所有主要的显微镜制造商都为他们的研究级显微镜生产 DIC 配件,这些配件通常捆绑在一起作为包含所有必需硬件和光学组件的匹配套件。在标准配置中,微分干涉对比显微镜(见图 1)包含通常在偏光显微镜上遇到的偏光元件,此外,还有两个特殊构造的双折射复合棱镜。称为WollastonNomarski棱镜,这些光学分束器(和光束组合器)的定位是将剪切波前的干涉图案投射到聚光镜前焦平面和物镜后焦平面中。

图 1 中显示的是透射微分干涉对比显微镜的典型光学系统配置。从灯丝中的局部邻域发出的半相干波前通过位于显微镜底座中的光端口和聚光器组件之间的线性偏振器。复合 Nomarski 或 Wollaston 棱镜位于聚光器孔径(前焦平面)内或附近,用于将入射偏振波前对齐和剪切成两个正交分量。垂直的剪切波前由聚光透镜系统聚焦成平行束,这些束穿过试样平面,并根据试样的光路长度参数通过变形响应折射率和厚度梯度。

物镜收集的光波会聚在第二个 Nomarski 棱镜所在的后焦平面。物镜 Nomarski 棱镜将剪切和变形的波前重新组合成线偏振光和椭圆偏振光,然后通过位于物镜上方中间管中的分析器(第二个偏振器垂直于台下偏振器定向)的组件。后,从分析仪发出的线偏振光分量通过目镜光阑(或相机投影镜头)中的图像平面上的相长干涉和相消干涉重新组合。

DIC 显微镜用偏光元件

DIC 显微镜中使用的偏振片与用于偏振光观察的偏振片相似或相同,但许多制造商提供匹配的 DIC 偏振滤光片,它们具有低透光率和高透光率。在放大倍数范围的上限(40x、60x 和 100x),DIC 首选具有高传输效率的偏光片,因为可以更清晰地描绘样本细节,并且可以将更大的偏置延迟值用于视频和数字成像。低透射偏振滤光片对于使用 10x 和 20x 物镜的 DIC 观察很有用,但在更高的放大倍数下严重限制了光透射。

在大多数显微镜上,偏振器直接安装在仪器底部的光端口上或安装在聚光镜下方的滤光片支架上。设计用于跨越光端口的偏振器通常安装在一个旋转组件中,使显微镜能够将滤光片旋转 90 到 180 度角(见图 2(a))。一旦将旋转偏振器定位在所需的透射方位角,就可以使用锁定螺钉将其固定到位。按照惯例,偏振器的方向是振动传输轴位于东西方向(站在显微镜前时从左到右)。将偏光器连接到台下聚光器安装支架的显微镜配有一个外壳,该外壳可能会或可能不会使偏光器旋转(图 2(b)和 2(c))。具有圆形几何形状的偏振器安装在舞台的支架中,并且可以以 45 度的固定增量旋转并带有缓和作用。其他偏振器安装在矩形框架中,该框架滑入聚光镜支架的槽中(图 2(b) 和 2(c)),并且通常包含能够旋转 180 到 360 度的指轮。

在配备 DIC 观察的显微镜中,分析器放置在物镜 Nomarski 棱镜和目镜观察管之间,类似于这些组件在偏光显微镜中的位置。检偏器也是一个线性偏光器,它的透射方位角与偏光器的方位角成 90 度角。按照惯例,分析器的振动方向是南北,这与为偏振器规定的东西方向一致。

分析仪的显微镜安装配置与偏光器的安装配置一样多变,这些组件通常插入光学系统的多个位置。在某些显微镜中,分析仪固定在矩形框架中(图 2(e))并插入物镜转换器、中间管或垂直照明器的插槽中。其他分析仪设计具有相同的框架样式,但允许使用通常以 10、45 或 90 度增量分级的指轮旋转分析仪元件(图 2(f))。为 DIC 观察配备的偏光显微镜通常将分析仪放置在位于物镜物镜转换器和观察管之间的中间管中(见图 2(d))。这些装置通常设计用于偏振光下的精确测量,并具有环绕圆周的 360 度刻度游标,带有锁定机构以将分析仪固定在所需的传输方位角。此外,分析仪通常安装在滑块上,以便可以方便地将其从光路中取出,进行线偏振或明场观察。用于偏光显微镜的中间管也包含一个 20 × 6 毫米用于四分之一波长、全波或 de Sénarmont 补偿器的DIN标准插槽(图 2(d) 和图 5)。

现代显微镜将偏振器和分析器放置在与场镜、聚光镜、物镜和观察管相关的重要位置。在较旧的显微镜中,可以发现这些偏光元件安装在各种位置。然而,应该注意的是,将偏光元件放置在共轭图像平面(视场光阑、样品台或目镜固定光圈)中或非常靠近它并不是一个好主意,因为玻璃上的划痕、瑕疵、污垢和碎屑表面可以与样品一起成像。

聚光镜和物镜棱镜

DIC 聚光棱镜作为分束器对入射偏振光波前产生角剪切,通常安装在旋转转塔聚光镜中,设计用于容纳至少三个单独的棱镜,如图 3 所示。转塔规格和配置根据不同的制造商,但它们通常包含 4 到 8 个辅助组件的插槽,包括 Wollaston 或 Nomarski 棱镜、相差环形环或暗场光挡。图 3 所示的聚光器转塔包含七个开口,其中三个填充有相差环,三个填充有 DIC 棱镜。开槽用于明场观察。

每个聚光镜 DIC 棱镜(也称为补偿器辅助棱镜)必须专门匹配一个狭窄范围的物镜数值孔径,因此一个特定的棱镜可能只适用于一个或两个物镜(例如,10x 和 20x)。因此,必须使用三到五个聚光棱镜来匹配 10 到 100 倍的整个物镜放大倍率范围。一些制造商为特定的物镜定制每个聚光棱镜,因此需要多达七个聚光棱镜来跨越具有不同数值孔径的干式和油浸式物镜的整个光谱。

聚光镜 DIC 棱镜插件由阳极氧化圆形铝板构成,其组合棱镜(通常为圆形)用光学胶固定在精确的方向上。DIC 棱镜楔块非常薄,切割公差很小,以确保角剪切值与物镜数值孔径所需的值相匹配。必须小心处理抛光板,以避免被指纹、油污、污垢和碎屑污染。每个棱镜框架包含一个插槽或销,与聚光镜转塔中的相应伙伴配合,以定义和确保聚光镜棱镜相对于物镜棱镜和偏振器(和分析器)轴的对齐。

位于物镜和分析器之间的是第二个 Nomarski 复合棱镜,用于重新组合由聚光棱镜剪切的波前(图 1、4 和 5)。这个棱镜,通常被称为目标主要DIC 棱镜可以与特定的聚光棱镜匹配,或者单个物镜棱镜可以用于重新组合具有所有聚光棱镜代表的剪切角光谱的波前。大多数显微镜制造商将他们的 DIC 显微镜配置为采用单物镜 Nomarski 棱镜,该棱镜安装在滑入物镜转换器的矩形框架中(见图 4)。为了将偏置延迟引入 DIC 光学系统,物镜棱镜位于滑动支架上,该支架可以通过千分尺控制旋钮在显微镜光轴上来回平移。

旨在通过跨显微镜光轴平移引入偏置延迟的物镜 DIC 棱镜制成矩形,长轴对应于棱镜剪切方向(图 4(b))。在正确对准的 DIC 显微镜中,聚光棱镜通过聚光镜和物镜系统的共同作用成像到物镜棱镜上。结果,聚光棱镜产生的波前切变在沿两个棱镜表面的每一点都精确匹配(相对于彼此倒置)。沿剪切轴平移任一棱镜会产生波前不匹配(偏置延迟),这反过来又会在显微镜孔径上引入均匀的光程差。

图 4 说明了来自不同制造商的几种物镜棱镜滑块设计。所有复合棱镜都安装在矩形框架中,框架末端有一个平移控制旋钮。控制旋钮用于沿剪切轴横向移动棱镜位置(图 4(b)),以便将偏置延迟(或净波前光程差)引入微分干涉对比光学系统。为反射光 DIC 显微镜设计的 Nomarski 棱镜滑块还包含第二个控制旋钮(图 4(c) 和 4(d)),可以调整棱镜高度以匹配整个物镜放大率和数值孔径范围内不同的后焦平面位置. 当显微镜在另一种成像模式下操作时,

在设计用于使用 de Sénarmont 补偿器引入偏置延迟的 DIC 显微镜中,物镜 Nomarski 棱镜用固定安装座固定,该安装座滑入物镜上方的物镜转换器(图 5(c))。使用 de Sénarmont 补偿器的显微镜需要为每个物镜配备单独的物镜棱镜,但通常可以为两个或更多物镜使用相同的聚光镜 Nomarski 棱镜。通过将框架从显微镜物镜转盘上滑动,固定物镜棱镜安装座(图 5(c))可以很容易地从光路中移除。

图 5(a) 说明了用于 de Sénarmont 微分干涉对比的典型偏振器和四分之一波长延迟板配置。该装置安装在显微镜底座上的视场光阑调节旋钮上,在延迟板光轴和偏振器透射方位对齐后,用锁定固定螺丝固定在旋钮上。偏振器轴标在 de Sénarmont 补偿器单元的正面,刻度尺使操作员能够定性地确定当偏振器旋转时引入系统的偏置延迟的大致量。锁定旋钮可用于使偏振器相对于四分之一波长板保持不动。对于没有 DIC 的明场观察或增强对比度技术,

de Sénarmont DIC 补偿的另一种技术是将四分之一波长补偿板放置在物镜 Nomarski 棱镜和分析仪之间的光学系统中。在这种情况下,要么在聚光棱镜下方使用标准线性偏振器,要么将图 5(a)中所示的 de Sénarmont 补偿器设置为偏振器轴平行于延迟板快轴(仅线性偏振光从补偿器中出射)并垂直于分析仪。设计用于在物镜棱镜后引入 de Sénarmont DIC 补偿的中间管如图 5(b) 所示。在这种情况下,通过旋转分析器而不是偏振器将偏置延迟引入光学系统。

配备用于观察物镜后焦平面的 Bertrand 透镜,图 5(b) 中显示的中间管还具有 DIN 标准插槽,能够容纳各种延迟板,包括 de Sénarmont 补偿器(如图所示)。分析仪可以通过精密刻度游标机构旋转,使操作员能够定量确定引入 DIC 光学系统的偏置延迟水平。使用 de Sénarmont 补偿器,可以轻松测量二十分之一和全波长之间的偏置延迟值,精度为 0.15 纳米。此外,Bertrand 透镜可以通过指轮方便地插入光路中,以便观察物镜后焦平面上发生的事件。

在 DIC 显微镜中,对比度是标本方向的函数,遇到的各种几何形状通常需要重新定位标本,以大限度地提高对比度效果,以便观察目标结构。尽管x - y平移机制减轻了仔细检查显微镜载玻片全部内容的负担。为了让样品能够轻松旋转和操纵以呈现佳方位对比度,建议使用类似于图 6(a) 所示的圆形旋转台用于 DIC 显微镜。圆形载物台可以使样品 360 度旋转,这对于在 DIC 中显示极端方位角对比度效果的扩展线性样品(例如硅藻或丝状结构)来说通常是必需的。观察过程中标本的平移是通过使用分级机械载物台附件 (图 6(b)) 来辅助的,该附件直接连接到圆形载物台并牢固地夹住显微镜载玻片。载物台应沿显微镜光轴居中,

为微分干涉对比设计的物镜必须没有应变或双折射遮挡,这些遮挡会使光去偏振并导致图像质量下降。过去,显微镜师仅限于用于在偏振光下观察的无应变消色差物镜和萤石物镜,但现在可以将具有更高校正系数的现代物镜用于 DIC 显微镜。称为通用物镜,这些先进的透镜系统通常可用于组合 DIC、荧光、相差和明场显微镜,而无需更换物镜。此外,新的复消色差物镜已设计为足够无应变,可用于偏振光和微分干涉对比观察,在更高放大倍数下显着提高图像质量和分辨率。

微分干涉对比显微镜对准

在尝试配置显微镜以进行微分干涉对比观察之前,请检查仪器以确定是否存在所有必要的组件,并且没有棉绒、灰尘和碎屑。包含应力特征的物镜和聚光镜元件会降低 DIC 中的图像质量,也会使透镜表面变脏、划痕和光路中的异物污染。显微镜的正确对准对于获得佳结果和产生显示伪三维和阴影投射效果的图像至关重要。以下程序中概述的许多步骤仅在首次将显微镜对准 DIC 时才需要,不需要重复进行日常观察。每次将显微镜用于 DIC 调查时,应采取其他步骤。

初步显微镜检查- 仔细检查显微镜,确保所有必要的 DIC 组件都已安装,或在必要时可用并准备好使用。拆下聚光镜,拆卸转塔,并检查 Nomarski 或 Wollaston 棱镜的状况。这些复合棱镜的表面应该干净,没有灰尘和碎屑。由于它们安装在聚光器转盘内,DIC 聚光棱镜很少被指纹污染,但灰尘和棉绒很容易流入转盘并落在其中一个平坦的石英表面上。要清洁受污染的棱镜表面,请使用橡胶气球去除松散的纤维和灰尘,和/或用镜头纸或湿软棉轻轻擦拭表面。小心不要刮伤表面。应给予物镜棱镜相同的处理,聚光镜和物镜外部透镜元件、显微镜目镜以及显微镜底座视场光阑端口处的物镜(或连接到倒置显微镜的支柱)。确保关键部件清洁后,重新组装显微镜,安装偏光器和分析器,然后将光学系统对准科勒照明。

安装偏光器和分析器- 拆开显微镜(聚光镜、DIC 棱镜和至少一个物镜移除),分别在聚光镜下方和物镜上方安装偏光镜和检偏器。以类似于偏光显微镜的方式,偏光器和检偏器的位置使它们的透射方位角彼此交叉成 90 度角(垂直)。安装在光源和聚光镜之间的偏光器传统上是东西方向的,或者当面对显微镜时从左到右。在某些情况下,偏光器和检偏器的位置由它们在安装框架中的固定位置预先确定,并且这些组件只能以单一方向插入显微镜光路中。通常,偏光器底座上的标记指示传输方向,但有些显微镜配备了以度数分级的旋转偏光器底座(图 2)。分析器也可以用刻度旋钮旋转,和/或可以包含指示传输轴的标记。

当偏振器和分析器交叉时(透射轴以 90 度角定向),通过目镜观察时,视场显得非常暗。这种情况被称为大灭绝如果大量光线穿过显微镜并且视野不暗(或几乎是黑色),请检查以确保偏振器和分析器交叉。穿过偏光镜后,插入聚光镜和物镜,但不要安装物镜 Nomarski 棱镜滑块(或固定安装座)。将聚光镜转塔旋转到明场位置(没有相位板或 DIC 棱镜的插槽)。视场应该保持黑暗,但如果这些组件(聚光镜或物镜)中的任何一个包含应变的透镜元件,一些光线可能会通过。在进行下一步之前,从光学系统(偏振器或分析器)中取出一个偏振元件。

建立科勒照明- 在进行 DIC 配置之前(安装偏光片后),显微镜光学系统应使用标准科勒技术对准明场标本观察。正确配置后,光源(通常是卤钨灯)的图像应通过安装在灯箱中的聚光透镜或沿着显微镜框架底座内的光学系统投射到聚光镜孔径光阑平面上。同时,聚光镜系统还将视场光阑的图像投影到样品共轭平面(在显微镜阶段)。在灯丝居中后(大多数现代灯箱都包含一个预先居中的灯),0B位置)。将隔膜聚焦,使用 10 倍物镜叠加在聚焦标本上,然后打开虹膜叶,直到在视场的外围边缘只能看到一小部分隔膜。对所使用的每个物镜都采取类似的步骤,确保通过调整视场和孔径光阑依次为每个物镜正确配置显微镜,以实现科勒照明。在 DIC 的日常观察过程中,应定期检查显微镜以确保保持科勒照明。

检查物镜后孔径- 为科勒照明配置显微镜后,插入偏振器和分析器,并用相位望远镜或伯特兰透镜(锥光观察模式)检查物镜后焦平面。如果偏振器和分析器的位置正确且显微镜完全对齐,则物镜孔径中将出现暗消光十字,如图 7(a) 所示。消光十字的臂应垂直和水平定向,在光圈的四个角出现少量光线(图 7(a))。十字或高双折射区域中的亮点会影响消光十字的完整性,是光学应变的指标。此外,位于共轭孔径焦平面(聚光镜或物镜)附近的灰尘和棉绒颗粒在物镜后孔处观察时会显得很亮。如果存在双折射点,请检查另一个无应变物镜以确定第一个物镜或聚光镜系统是否应变。在进行下一步之前,清除物镜或聚光镜表面上的任何污染灰尘并更换紧张的光学组件(如果可能)。

物镜 DIC 棱镜对准- 通过插入滑块(图 4)或限制在固定支架上的棱镜(对于利用 de Sénarmont 偏置延迟的系统;见图 5)来安装物镜棱镜。一旦棱镜就位,用相位望远镜或伯特兰透镜再次检查物镜后焦平面。视场现在应该看起来非常明亮,但没有特征,有一条暗干涉条纹沿着剪切轴以 45 度角(见图 7(b))延伸穿过孔径的直径根据显微镜是直立还是倒置,干涉条纹将在东北-西南(直立)或西北-东南(倒置)方向穿过物镜后孔径。在任何一种情况下,干涉条纹都应该被很好地定义,如图 7(b) 所示,并位于孔径的中心。

在一些 DIC 显微镜设计中,物镜棱镜是固定的(de Sénarmont 补偿),而在其他设计中,棱镜可以通过滑块框架中的定位螺钉机构在光轴上来回平移。在后一种情况下,在通过望远镜或伯特兰透镜观察物镜后焦平面的同时,慢慢转动调节旋钮。转动旋钮时,干涉条纹应远离其中心位置移动到明亮后孔的上半部分或下半部分。或者,转动 de Sénarmont 补偿器中的偏光器将产生相同的效果。

聚光DIC 棱镜对准- 从光学系统中取出物镜棱镜,并通过旋转聚光镜转台将低孔径的聚光镜棱镜(用于 10 倍物镜)摆动到位。合适的位置通常用炮塔上的红色或白色10设置(或类似的代码,如L)。重新聚焦相位望远镜或伯特兰透镜,观察出现在物镜后焦平面上的干涉条纹。再一次,单个条纹应该与物镜棱镜产生的条纹具有相同的方向(正置显微镜的东北-西南或倒置显微镜的西北-东南)。聚光镜和物镜棱镜的干涉条纹应该看起来几乎相同,并且沿着剪切轴具有相同的方向。

为了使用专为油浸设计的高数值孔径聚光器清楚地观察聚光器棱镜干涉条纹,可能需要使用摆动镜头控制杆卸下前镜头组件。如果出现在物镜孔径中的条纹位置不正确,则可能需要调整聚光棱镜的方向或对准。在大多数情况下,聚光镜棱镜组装在带有凹槽或销(或锁定螺钉)的保护性圆形铝制框架(图 3)中,以确保在聚光镜转盘内正确定位。有时,聚光棱镜可能会在没有正确对准的情况下被迫进入转塔,这在检查干涉条纹时会很明显。如果聚光棱镜看起来没有对齐,

标本观察- 将显微镜对准科勒照明,将偏振器和分析器交叉,安装两个棱镜(物镜和聚光镜),在载物台上放置一个薄的透明样品(如颊粘膜上皮细胞制剂)。调整显微镜以获得大消光,并在通过目镜以正视模式(无伯特兰透镜或相位望远镜)观察过程的同时聚焦样品。在视场中观察到的图像应该看起来非常深灰色,几乎是黑色,在大消光处,在具有明确定义的厚度或折射率梯度的区域(例如,细胞膜和细胞核;见图 8(b))具有明亮的亮点。具有高折射率的球形样品,例如浸油滴,甚至可以充当微小的透镜,

在观察聚焦标本图像时,使用滑块旋钮平移物镜 DIC 棱镜或在配备 de Sénarmont 补偿的显微镜中旋转偏振器(或分析器)。这个动作被称为引入偏置延迟,并将沿剪切轴平移将试样平分的干涉条纹,并对试样外观产生相应的变化。将棱镜向一个方向移动(正偏置)将使一侧边缘的样品特征变亮,同时使另一边缘的相同特征变暗,同时使背景变亮(见图 8(a))。通常,试样呈现伪三维外观,具有与剪切轴方向相同的阴影投射效果。将棱镜移动到显微镜光轴的另一侧(负偏置)将反转亮暗样品区域(比较图 8(a)和图 8(c))。

在所有 DIC 组件正确安装和对齐的情况下,当使用相位望远镜或伯特兰透镜(图 7(c))观察时,在大消光度时,物镜后孔径呈现深灰色(几乎黑色)并且相对均匀。在大多数情况下,后光圈的中央区域呈现出漆黑的外观,而外围的四个象限中则出现了一些光线迹象。消光十字通常看起来与单独使用交叉偏振器观察到的非常相似,但通常更暗,并覆盖物镜后孔的更大区域。外围的明亮区域 (图 7(c)) 是由聚光镜和物镜中偏振器和透镜元件表面的光的部分去偏振引起的伪影产生的。

通过掩盖物镜后孔中消光十字周边的明亮区域,可以显着改善微分干涉对比度图像。这是通过减小聚光器孔径光阑的尺寸以消除亮边来实现的。一般来说,物镜后孔径尺寸应与聚光膜一起减小到全孔径的大约 75% 或 80%。当光学系统完全对准时,消光十字出现直立(见图 7),可以观察到由两条宽干涉条纹组成,每条干涉条纹都成直角并在物镜后孔的中心相遇(条纹也可以在较低质量的显微镜中以正畸模式进行可视化)。

在某些显微镜上,可以调整聚光镜和物镜棱镜的位置,以产生更均匀的条纹图案,从而使孔径的中心区域显得更暗、更均匀。此任务是通过松开和旋转(或升高或降低)聚光棱镜或通过将偏振器和分析器分开几度来完成的。有时显微镜包含固定螺丝,可以调整聚光镜和物镜棱镜,但配备这种设备的型号变得越来越少。作为对显微镜对准的后检查,调整聚光镜聚焦旋钮,同时检查物镜后孔中的消光模式,以确定是否可以改进。

通过平移物镜棱镜或在 de Sénarmont 配置中旋转偏振器来调整偏置延迟,显着改善了图像外观(在大消光时观察到的)并增加了对比度。这种操作对于微分干涉对比中的样品成像至关重要,并且代表了显微镜光学系统调整的后一步。在许多情况下,观察 DIC 图像时,整个视野都会出现光梯度。除了在样品的相对边缘存在明暗强度之外,还会发生这种情况,这是由于光学系统产生的宽且模糊的场条纹伪影。具有匹配良好的光学元件的显微镜可大限度地扩大场条纹的尺寸,它可以变得如此广泛和均匀分布,以至于整个场呈现出均匀的中灰色。然而,在大多数情况下,边缘的一些证据仍然存在,并且视场显示出从一个外围边缘到另一个外围边缘的浅梯度光强度(中等至浅色或更深的灰色阴影)。这种伪影是特定光学配置所固有的,在观察和收集 DIC 标本的图像时应被忽略。

DIC 显微镜中的补偿器

还可以通过在 DIC 显微镜的光路中引入延迟板(或补偿器)来增加样品对比度。通常,全波(也称为一补偿器)板插入物镜棱镜和分析器之间的中间管中,尽管该板也可以位于偏振器之后但在聚光棱镜之前。这些板在绿色区域(通常接近 550 纳米)的指定值处表现出整个波长的延迟水平,并导致样品沿折射率和厚度梯度显示黄色和蓝色牛顿干涉色。由于从白光中减去绿色波长,背景呈现为洋红色。

在 de Sénarmont 或标准(可平移)Nomarski 棱镜 DIC 显微镜配置中,当物镜棱镜与消光干涉条纹位于光路中心时,在物镜后焦平面(假设聚光棱镜从光路中移除)。如果然后将全波延迟板放置在物镜棱镜和分析器之间,则图 9(a) 中所示的干涉图案显示了牛顿干涉色的光谱,出现在物镜后焦平面上。从光路中取出物镜棱镜并插入聚光棱镜产生图 9(c) 所示的图案。

在 de Sénarmont 补偿器配置中平移物镜 Nomarski 棱镜或旋转偏振器将改变图 9(b) 中所示的牛顿干涉图案颜色。引入负偏差会将牛顿颜色转换为减色值(黄色),而将棱镜转换为正偏差值将导致加色(蓝色)。样品梯度产生的颜色可以与 Michel-Levy 参考图进行比较,以确定光程差异的大小。

DIC 显微镜配置错误

当微分干涉显微镜配置正确时,生成的图像通过看起来源自高度倾斜角的阴影投射效果显示出伪三维度中的真实感(参见图 10(a))。然而,即使是轻微的对齐错误也会导致微小样本细节的恶化,配置中的严重错误会导致对比度的显着损失,从而使图像变得毫无用处。DIC 显微镜配置中常见的错误是由未交叉的偏光镜、物镜和聚光棱镜之间的不匹配、聚光镜 DIC 棱镜丢失或聚光镜光圈设置不正确造成的。可能会出现其他问题,特别是如果聚光镜和/或物镜不是无应变的,

确保偏振器交叉并以正确的方向定位在前面的显微镜对准部分中讨论过。有时,偏光器或检偏器可能会因摩擦指轮或不小心使用仪器而意外旋转错位。结果,整体标本对比度降低,但许多特征通常仍然可见。这种类型的错误可以通过使用固定的偏振器和分析器或通过确保锁定旋钮设置为暂停偏振器旋转来消除。大多数安装在旋转安装座中的偏振器都包含指示传输方位角位置的标记。在开始 DIC 观察之前仔细检查偏振器和分析器的方向将避免这些组件的错误。

物镜和聚光器棱镜之间的意外不匹配是微分干涉对比显微镜中另一个常见的错误来源。由于未设计为一起工作的棱镜之间的剪切角差异,所得图像的对比度极差(参见图 10(c),无法通过在 de Sénarmont 补偿显微镜中平移物镜棱镜或旋转偏振器来校正。聚光镜转台通常标有一个代码,用于识别放置在光路中的棱镜。检查外部代码顺序以确保聚光棱镜位于正确的插槽中将有助于避免此类错误。此外,棱镜代码刻在物镜筒上的代码应与使用的聚光棱镜代码相匹配。一般来说,当放大倍数改变时会发生棱镜不匹配,但聚光镜转盘没有旋转以将匹配的棱镜插入光路。有时,聚光镜可能缺少聚光棱镜,或者聚光镜转盘旋转到包含棱镜的位置(例如,明场位置;见图 3)。结果是类似于图 10(c) 中所示的图像,该图像缺乏对比度并且不显示可通过微分干涉对比度获得的高分辨率。

聚光镜光圈通常用于调整在目镜中观察到的图像或以数字方式记录在胶片上的图像的景深和对比度。在微分干涉对比显微镜中,大孔径尺寸对于需要浅景深但也需要高分辨率的光学切片实验非常有用。通常,通过消除远离焦点平面的干扰样本特征,可以抵消使用较小孔径提供的大对比度之间的折衷。如果聚光器孔径未充分打开(约四分之三到五分之四的物镜孔径),衍射伪影会掩盖重要的标本细节并严重降低图像外观(图 10(b))。一般来说,

当使用浸入水中的厚样品时,或者当玻璃显微镜载玻片、培养皿或盖玻片太厚时,球差可能会导致额外的误差。这些错误表现在图像没有清晰聚焦并且缺乏 DIC 图像特有的阴影浮雕。高倍干物镜上的校正环通常可以调整以校正球面像差,但太厚的样品必须更换为更薄的切片。在检查培养中的细胞时,请勿将 DIC 光学系统与由注塑聚合物制成的培养容器一起使用。这些材料显示应力双折射并且会产生令人困惑的图像。相反,使用专为 DIC 显微镜设计的玻璃容器,这些容器可从多个制造商处获得。一般来说,

DIC 显微镜的光源

在较低的放大倍数(10 倍到 40 倍)下,50 瓦石英卤素灯可以提供足够的光线,以便在 DIC 中进行令人满意的图像观察和记录。但是,在高放大倍数(60 倍和 100 倍)下,建议使用至少 100 瓦的卤钨光源。光源所需的照明强度取决于偏光器和分析器的透射百分比,许多较旧的 DIC 显微镜配备的偏光元件具有低透射值(20% 或更低)。然而,较新型号的显微镜通常配备高透射偏光镜(大于 30%),这使得更高的通量密度能够通过光学系统,为在高放大倍率下进行观察和成像提供足够的光线。

尽管可以使用高强度卤化钨灯轻松观察粗略的结构细节,例如细胞边缘和较大的细胞内成分(细胞核),但为了观察精细的结构细节,具有窄带宽的非常强的照明是必不可少的. 汞弧光放电灯在可见光谱中心部分 546 纳米(绿色)处具有高能量峰值,可通过以 546 纳米为中心的窄带宽(10 纳米)干涉滤光片进一步细化。此外,可以使用光扰码器来增强窄带宽照明,以实现尽可能高的分辨率。请注意,无论光源如何,物镜光圈都应完全照亮,以获得佳效果。

结论

无论目标放大倍数和分辨率如何,在微分干涉对比显微镜中正确放置和定向光学组件对于获得佳性能都至关重要。即使是单个组件的不当调整也会导致严重的图像质量下降,并影响仪器的阴影投射效果和分辨率。DIC 显微镜中的两个复合棱镜及其相关的偏振器是镜像对。通过初始偏振器和聚光棱镜的光波被成像到物镜棱镜和分析器上以产生终图像。所有这四个组件都必须处于正确的方向,以便 DIC 正常运行。通过改变物镜棱镜的横向位置产生对比度,或通过在 de Sénarmont 补偿仪器中旋转偏振器。以这种方式,波前之间的光程差会增加或减少,以在样本中产生对比度。

应该注意的是,DIC 中的对比度是样品光路长度梯度的函数,当显微镜适当调整时,它会呈现为伪三维浮雕。因为对比度是由折射率波动和/或厚度变化的组合引起的,使用该技术观察到的表观梯度可以对应于样本地形的真实变化,或者可能是局部蛋白质浓度梯度的函数。只有与标本相关的结构特性的独立知识才能帮助确定 DIC 显微镜中对比度效应的绝对性质。

此外,即使确定阴影投射效果可以真正归因于试样的高度变化,DIC 中也没有内在机制来指示哪些特征代表物镜棱镜特定设置下的高原或山谷。该问题的定性解决方案是定位已知的样本特征,例如玻璃中的划痕,并观察该特征如何在物镜棱镜横过光轴平移时对偏置延迟做出响应。具有相似响应的整体试样特征将是谷或平台,而具有相反响应的那些将具有相反的方向。

当用微分干涉对比检查未知样品时,显微镜师应警惕边缘出现的干涉色,这些干涉色通常没有特征,根据方向的不同,呈现出非常浅或深的颜色。干涉色的存在表明样品可能是双折射的,因此不适合 DIC 观察。这个事实可以通过在交叉偏振照明下检查样品来确认,物镜和聚光镜 DIC 棱镜都从光路中取出。

对微分干涉对比显微镜施加的限制之一是执行该技术所需的昂贵的双折射 Nomarski 或 Wollaston 棱镜。这些组件比相差显微镜或霍夫曼调制对比度显微镜所需的组件贵得多,后者可以作为替代技术,尤其是在观察塑料容器中的活细胞时。此外,当使用相衬代替 DIC 时,非常薄或分散的样本通常会产生具有更高对比度的更好图像。较旧的复消色差物镜可能不适合 DIC 观察,因为物镜本身会显着影响偏振光。在购买与 DIC 光学组件结合的高质量复消色差物镜之前,显微镜师应与制造商核对。