奥林巴斯荧光显微镜CCD数字相机如何选择

2021-11-16 14:58:07 admin 2

显微镜照相术和材料技术科技发展日新月异的今天,尤其是荧光显微镜摄像的提取,发展到了新的高度,在五花八门的相机中,如何选择适合荧光显微镜相机至关重要。

在过去几年中,快速发展的荧光显微镜领域已经从依赖使用基于乳剂的胶片的传统显微摄影发展为电子图像是首选输出的领域。成像设备是荧光显微镜中最关键的组件之一,因为它决定了在什么水平上可以检测到样本荧光、解析相关结构和/或可视化和记录过程的动力学。

当前可供显微镜使用的光检测方法的范围和种类繁多的成像设备使选择过程变得困难且常常令人困惑。本讨论旨在帮助理解光检测的基础知识,并为为荧光显微镜中的特定应用选择合适的检测器提供指导。图 1 所示的是落射荧光显微镜,配备最先进的百万像素数字成像相机系统和珀耳帖冷却,旨在在低光照水平下以 24 位颜色在宽曝光范围内对样品进行成像。此类探测器以及其他替代品将在以下段落中进行审查。

检测器表征参数

电子成像传感器的性能可以通过许多变量来描述,包括:光谱灵敏度、量子效率、空间分辨率、均匀性、信噪比、动态范围和响应速度。这些规范中的每一个都在我们回顾数字成像技术概念的部分中详细讨论,但为了方便起见,此处包含了简要说明。光谱灵敏度是指作为入射光波长函数的检测器信号。该参数通常用量子效率(QE),检测器根据检测到的入射光子的百分比产生电荷的能力的量度。限制空间分辨率通常由区分两个高对比度对象(例如,黑色背景上的白点或线条)所需的最小间隔确定。对比度是分辨率的一个重要因素,因为高对比度对象(例如黑线和白线)比低对比度对象(例如相邻的灰线)更容易分辨。

电子探测器空间分辨率的更多信息量度是调制传递函数 ( MTF ) 和对比度传递函数 ( CTF ),这两个函数都表明探测器响应的幅度是空间频率的函数。CTF 是根据探测器对一系列逐渐变窄和靠近的黑白条的响应来确定的。每对条形基本上是一个具有 100% 对比度的方波。MTF 是描述正弦信号(60% 对比度正弦波)的对比度降低作为空间频率的函数的表达式。电子探测器的极限分辨率是在噪声阈值以上可探测到的最小目标尺寸,这个概念通常被称为极限分辨率的频率,它是 MTF 下降到 3% 值的空间频率,对应于可见光检测的极限。

电子探测器的均匀性包括几个变量:传感器的增益变化、噪声和采样效率的区域差异(通常称为阴影)以及光收集或传输效率的空间变化。电子探测器通常通过它们的信噪比(指定的S/N),信号变化的一种度量,表示可以估计信号幅度的置信度。可见光具有由光子通量的随机性质引起的固有噪声分量,其等于信号的平方根。噪声还来自各种其他来源,例如输出放大器(读取噪声),在电子设备中,通常可以通过降低工作温度来减少噪声。在没有光的情况下,电子设备中产生的噪声称为暗电流暗噪声,它们对热很敏感,随着检测器温度的增加而增加。

场景内动态范围源自可以在同一视场中同时检测到的最大和最小强度。 场景间动态范围表示在针对不同视场调整探测器增益、积分时间、镜头孔径或其他变量时可以适应的强度范围。不应混淆术语动态范围和信号/噪声。动态范围通常计算为可以累积的最大信号除以与读取该信号相关的噪声。电子探测器的响应速度用它的滞后来描述,表示在规定的时间间隔过去后,前一图像延续到下一个图像的比例。

电子检测光

缺乏空间辨别力的常用光检测器的两个例子是光电倍增管和光电二极管(如图 2 所示)。这两种设备都采用光敏表面来捕获入射光子并产生被感测和放大的电荷。光电倍增管 ( PMT ) 广泛用于共聚焦显微镜和胶片相机的高端自动曝光机构以及光谱仪。当光子撞击光电阴极并释放电子,这些电子被加速到由一系列弯曲板(称为打拿极)组成的电子倍增器时,这些设备会做出响应。

进入 PMT 输入窗口的光撞击光电阴极,光电阴极利用入射光子的能量释放电子,其峰值量子效率最近已提高到约 40%(参见图 3 中的 GaAsP 曲线)。根据应用的不同,光电阴极活性区域的直径范围可以从几毫米到半米不等。

光电倍增管

通过放大暴露于光子通量的光电阴极产生的电子,了解光电倍增管的工作原理。

金属通道打拿极链的输出是与撞击光电阴极的光子数量和沿打拿极通道的电压降成正比的电流。光谱灵敏度取决于光电阴极的化学成分;最好的器件通常包含砷化镓,并且对波长范围为 300 到 850 纳米的紫外线、可见光和红外线敏感(图 3)。PMT 光电阴极不是均匀敏感的,通常光子分布在整个入射窗上,而不是集中在一个区域。由于 PMT 不存储电荷并在几纳秒内对输入光通量的变化做出响应,因此它们可用于检测和记录极快的事件。这些设备通常会产生低噪声值(和暗电流),从而产生巨大的动态范围,在该范围内电流输出仍能准确反映光子通量。这些器件表现出的大增益是在不牺牲带宽的情况下获得的,带宽范围可以从 100 到 1500 MHz,在科学级 PMT 中具有非常高的信噪比。

图 3 中显示了三个电子探测器的光谱灵敏度曲线,说明量子效率与照明波长的函数关系。其中两条曲线(图 3 中较低的曲线)是由 PMT 生成的,该 PMT 具有使用砷化镓磷化物的光电阴极组合物(Ga-AS-P) 或砷化镓 (Ga-As) 合金,而第三条曲线代表具有紫外线透明窗口的硅光电二极管的响应。

硅光电二极管也通过产生电流对光做出快速响应,但它们这样做并没有伴随 PMT 电子倍增带来的巨大增益。光电二极管在整个可见光谱范围内具有相对平坦的响应(图 3),具有 80% 到 90% 的高量子效率。光敏表面的均匀性非常好,这些设备的动态范围和响应速度在所有光检测器中都名列前茅。然而,硅二极管会产生大量噪声(其中大部分是热噪声),导致在光子有限条件下的信噪比相对较差,例如在荧光显微镜中很常见。已经开发了包含有限增益的光电二极管(雪崩光电二极管、如图 2 所示),并被用于一些共聚焦和宽视场荧光显微镜尽管它们具有高达 300 倍的增益,但即使在冷却至 0°C 时它们也会表现出明显的暗噪声。

雪崩光电二极管

当 p 和 n 半导体层之间的晶体结被照亮时,观察在高反向偏压下电子/空穴对的形成。

区域探测器

这些设备一般分为两类:管式和固态探测器。摄像管摄像机(如图 4 所示)是一种管式探测器,其中的光敏表面由扫描电子束“读出”。在摄像机中,光敏表面储存电荷而不是像光电阴极那样释放电子。光传感器捕获的光子会改变其撞击部位的电阻,并且扫描光束的电流更容易流过这些部位,从而产生信号。由于摄像管传感器已在很大程度上被现代固态探测器所取代,并且仅由于历史意义才引起人们的兴趣,因此不会进一步详细考虑它们。

固态探测器由包含电荷存储区的光电二极管的密集矩阵组成。基本概念的几种变体在商业上可用,包括流行的电荷耦合器件 (CCD)、电荷注入器件 (CID) 和互补金属氧化物半导体检测器 (CMOS)。在这些检测器中的每一个中,硅二极管光电传感器(通常表示为像素)连接到电荷存储区,而电荷存储区又连接到放大器,该放大器读出累积电荷的量。在 CID 和 CMOS 检测器中,每个单独的光电传感器都有一个与之关联的放大器,并且来自一行放大器的组合信号并行输出。尽管在 CCD 发展之前,硅光电探测器的电荷存储技术已为人们所知多年,在设备成为现实之前,需要设计一种合适的机制来系统地读出这种存储的电荷。在CCD中,整个阵列的拐角处通常只有一个放大器,存储的电荷依次通过并行寄存器传输到线性串行寄存器,然后传输到与读出放大器相邻的输出节点。

因为 CCD 是目前最广泛使用的荧光显微镜检测器,我们将更详细地考虑它的性能。将在适当的情况下区分两类 CCD 相机:消费级和科学级。需要指出的是,尽管所有电子检测器都是产生电流或电荷的模拟设备,但最近将带有内部数字转换器的相机称为数码相机,因为它们没有模拟信号输出。

一些用于科学应用的 CCD 相机在室温下运行,而其他相机则通过冷却来减少暗电流(温度降低 20°C 会使 CCD 的暗电流减少十倍)。由于在积分期间电荷存储阱不会充满热产生的暗噪声,因此可以进行更长时间的曝光。用于科学用途的冷却相机通常被指定为慢速扫描,因为它们的帧速率低于标准摄像机的帧速率。

视频速率相机每 16.7 毫秒读取存储的电荷并输出一个视频场,以符合推荐标准(表示为 RS-170 或 RS-330),其中每秒产生 30 个视频帧,每帧由两个隔行扫描场组成(欧洲标准格式要求每秒 50 个字段,每 20 毫秒一个字段)。视频通过以比临界闪烁频率更快的速度生成图像来利用我们视觉系统中的滞后,人眼不再感知闪烁的视频刷新频率。每个视频场,包含整个帧中 50% 的信息,是按顺序获得的,结果是整个图像中连续的奇数或偶数扫描线之间存在 16.7 毫秒的时间差。如果视频速率摄像机的输出停止并允许光线长时间照射在 CCD 上,则产生的前两个视频场包含积分期间积累的所有信息。

将两个视频场隔行扫描以生成完整的视频帧是解决电视发展时可用的电子设备和信号传输和接收组件的带宽限制所导致的工程问题的巧妙解决方案。现在,更高频率的放大器和相关电子设备允许以高达 1000/秒的帧速率进行生产、存储和后续显示,而无需交错扫描线。这种逐行扫描相机产生从图像顶部到底部的连续扫描。这并不意味着顶部线在底部线之前获得;相当,

两种 CCD 设计通常用于实现这种快速传输行间传输 CCD 和帧间传输 CCD,如图 5 所示。行间传输 CCD 包含紧邻每个光电二极管的电荷传输通道(在图 5 中称为“行间掩模”),以便累积电荷可以在图像采集完成后高效快速地转移到通道中。行间传输 CCD 可以通过改变光电二极管上的电压来进行电子快门,以便产生的电荷注入基板而不是转移到传输通道。这些设备还包括一个电子“漏极”以防止晕染,并且通常配备微透镜阵列以增加光电二极管的填充因子和量子效率。

帧传输 CCD 使用两部分传感器,其中平行阵列的一半用作存储区域,并通过不透光的掩模进行保护。允许进入的光子落在阵列的未覆盖部分,然后累积的电荷迅速转移到掩蔽的存储区域,以将电荷转移到串行输出寄存器。当信号被集成到传感器的光敏部分时,存储的电荷被读出。这种架构的一个缺点是在从感光区域转移到 CCD 的掩蔽区域期间会出现电荷拖尾现象,但这通常可以得到补偿。

帧传输 CCD 操作

探索帧传输 CCD 如何通过以并行方式一次一行地将图像信息行移动到串行移位寄存器来进行读出。

CCD 的光谱灵敏度不同于简单的硅光电二极管检测器,因为 CCD 表面具有用于电荷转移的通道,这些通道被多晶硅栅电极屏蔽。这些结构吸收较短的波长并降低设备的蓝光灵敏度。消费级或科学级 CCD 的典型光谱灵敏度曲线如图 6(标准 CCD)所示,其中 40% 的峰值量子效率明显低于单个硅光电二极管的峰值量子效率。最近,随着一些科学级 CCD(图 6 中的 Blue Plus 曲线)的蓝绿色灵敏度的显着提高,通道的透明度有所增加。在背照式 CCD 中完全消除了由于通道造成的损失。在这个设计中,光线落在 CCD 背面的一个区域,该区域已经通过蚀刻变薄,直到它变得透明(相当于大约 10-15 微米的厚度)。由此产生的光谱灵敏度曲线,也显示在图 6(背薄 CCD)中,说明了这种配置可以实现的高量子效率。然而,背部变薄导致传感器精致且相对昂贵,迄今为止,该传感器仅用于高端科学级 CCD 相机。

CCD 的分辨率是光电二极管数量及其相对于投影图像的尺寸的函数。1000 × 1000 传感器的 CCD 阵列现在在科学级摄像机中很常见。消费级和科学级 CCD 制造的趋势是减小传感器尺寸,目前消费市场上可以买到具有小至 4 × 4 微米的光电二极管的相机。具有 6.7 微米像素的 CCD 相机的典型 MTF 曲线如图 7 所示。投射到传感器表面的 60% 对比度正弦波的空间频率绘制在横坐标上,所得调制百分比绘制在纵坐标上。极限分辨率通常定义为 3% 的调制电平。

只有为每个可解析单元至少制作两个样本(许多研究人员更喜欢每个可解析单元三个样本以确保足够的采样)才能获得足够的对象分辨率。在落射荧光显微镜的情况下,使用 1.4 数值孔径透镜在 550 纳米波长处阿贝衍射极限的可分辨单位为 0.21 微米。如果采用 100 倍物镜,CCD 表面上衍射极限光斑的投影尺寸将为 21 微米。10.5 × 10.5 微米的传感器尺寸只能使光学和电子分辨率相匹配,首选 7 × 7 微米的传感器尺寸。尽管 CCD 中的小型传感器提高了空间分辨率,但它们也限制了设备的动态范围。


荧光显微镜最大光学分辨率的像素尺寸要求
物镜
(数值孔径)
分辨率
限制
(微米)

CCD 上的投影尺寸
(微米)
所需的像素
大小
(微米)
4 倍 (0.20)1.55.82.9
10 倍 (0.45)0.646.43.2
20 倍 (0.75)0.397.73.9
40 倍 (0.85)0.3413.66.8
40 倍 (1.30)0.228.94.5
60 倍 (0.95)0.3118.39.2
60 倍 (1.40)0.2112.46.2
100 倍 (0.90)0.3232.016.0
100 倍 (1.25)0.2323.011.5
100 倍 (1.40)0.2121.010.5
表格1

CCD 的电荷存储容量与单个光电二极管的尺寸成正比,因此存储的最大电子数约为每个光电二极管横截面积的 1000 倍。因此,具有 7 × 7 微米光电二极管的 CCD 的最大电荷存储容量(满阱容量)应为 49,000 个电子或空穴。空穴是电子来自硅的区域,构成检测到的光子的同样有效和可用的度量。尽管许多 CCD 读出产生的空穴数而不是电子数,但在整个讨论中将主要使用术语“电子”。由于 CCD 没有固有增益,因此每个检测到的光子都会累积一个电子-空穴对。CCD 的动态范围通常定义为全井容量除以相机噪声。相机噪声是暗噪声和读出噪声的正交总和。CCD 设计的最新改进已将暗电荷大大减少到可以忽略不计的水平,并将读出噪声减少到每像素约 10 个电子。即使是室温摄像机也可能具有如此低的暗信号,以至于在 10 秒或更短的积分周期内可以忽略它。冷却进一步降低了暗信号,并允许更长的积分时间,最多几个小时,而没有明显的暗电荷积累。因此,具有 10 电子读出噪声和可忽略暗噪声的 49,000 电子全阱容量 CCD 的动态范围约为 4900,需要 12 位模数转换,或 4,096 灰度级分辨率,

具有 49,000 个电子全阱容量的 CCD 的最大可实现信噪比约为 220(49,000 的平方根)。当然,相机噪声会正交地添加到光子统计噪声中,并将最大信噪比降低到该值以下。可以从感兴趣区域的平均强度除以该区域的强度的标准偏差来对图像中任何均匀区域的信噪比进行简单估计。

供消费者使用的相机通常具有长宽比为 4 : 3的矩形格式 CCD 。这意味着图像的高度将是宽度的 3/4,以符合基于我们对世界的横向视图的视频标准。事实上,为 HDTV 设计的最新一代消费级产品采用 16 : 9 的纵横比。另一方面,科学成像最好使用由方形像素组成的方形图像进行,因为它们更适合数字图像处理。

CCD 传感器的均匀性通常非常好,光电二极管之间的增益变化小于 10%。然而,由于电荷转移效率低下,可能会在 CCD 相机的图像中引入阴影。CCD 的操作要求将光电二极管下方的每个电荷包传输到读出放大器。这种传输是通过一系列并行和串行移位来实现的,这些移位沿着芯片将电荷行移向包含读出放大器的单个角落。如果读出放大器位于 1000 × 1000 传感器 CCD 的右上角,则离该角最近的光电传感器的电荷只需向上移动一次到串行移位寄存器(并行移位)和一次向右(串行移位)到达放大器。另一方面,左下角光电二极管的电荷必须向上移动 1000 次,向右移动 1000 次才能被读出。如果每次转换的传输效率为 99.9%,那么在必要的 2000 次转换后,左下方光电二极管累积的电荷中将只剩下 13.5%。这种电荷损失会使左下角比右上角暗得多,并且由于相邻光电二极管的电荷溢出,还会使图像的该区域变得模糊或模糊。该概念在图 8 中示意性地说明,使用蓝色像素表示积分电荷密度。CCD 左下角的像素(最远的像素 - 深蓝色)显示为随着电荷首先并行传输到串行移位寄存器,颜色强度逐渐降低,然后串行到输出节点。靠近节点的像素(右上角“最近的”像素)也用深蓝色表示,仅经历两步跳跃,在输出节点产生 99.8% 的累积电荷转移效率。

慢扫描 CCD 相机通过冷却 CCD 并减慢传输速率来提高电荷传输效率。视频速率 CCD 相机所需的高速电荷传输需要不同的策略。在这些相机中,读出放大器增益被调整以通过对图像区域外的额外像素进行采样来补偿每行损失的电荷。较低行所需的额外增益不可避免地增加了传感器高度校正区域中的噪声。

慢扫描 CCD 相机允许对读出速率以及构成传感器的像素大小进行一些控制。视频速率 CCD 相机更简单,并且不允许进行此类控制。减慢读出速度通常会降低与读取电荷相关的放大器噪声,当光子通量非常低并且信号可以相对较慢地产生(在一两秒内而不是 33 毫秒内)时,这是一种有益的情况。科学级 CCD 相机通常提供两个或多个读出率,以便在速度与噪声之间进行权衡。

科学级 CCD 中的像素大小可以通过合并来增加,在这个过程中,来自一组相邻光电二极管的电荷被汇集并被视为来自更大的探测器。在分箱中,在读出之前发生向串行寄存器和输出节点存储区域的几次电荷转移。分级的程度取决于读取存储电荷之前发生的移位次数,唯一的限制是串行寄存器的电荷存储容量(通常是单个光电二极管的两倍)或输出节点的电荷存储容量(通常是光电二极管)。在大多数荧光显微镜应用中,串行寄存器和输出节点的最大电荷存储容量不是问题,因为当光线水平非常低且检测到的光子很少时会采用分档。

CCD 像素合并

了解如何修改 CCD 时钟周期以在读出期间合并来自相邻像素的电荷。

市场上有多种科学 CCD,它们具有广泛的阵列和单个像素尺寸。表 2 列出了显微镜中使用的数码成像相机中最流行的几种 CCD。目前,最流行的 CCD 是 Sony ICX205AK 行间传输逐行扫描芯片,它支持 30 帧/秒的高帧读出率。该 CCD 具有 1360 × 1024 有源像素阵列,使用 4.65 × 4.65 微米方形像素产生 8 毫米的图像尺寸。该芯片还具有高灵敏度、低暗电流、低拖尾、优异的抗晕染特性和连续变速快门等特点。

CCD规格
制造商

型号
格式像素大小
(微米)
阵列大小
(毫米)
柯达
KAF-2001CE
1732 × 117213 × 1322.5 × 15.2
柯达
KAF-3000CE
2016 × 15129 × 918.1 × 13.6
柯达
KAF-3040CE
2144 × 14326.8 × 6.814.6 × 9.7
柯达
KAF-6302CE
3052 × 20169 × 927.5 × 18.1
柯达
KAI-4000
2048 × 20487.4 × 7.415.16 × 15.16
索尼
ICX205AK
1392 × 10404.65 × 4.657.6 × 6.2
现场
ST-002A
2048 × 409615 × 1530.72 × 30.72
马可尼
CCD 42-90
4608 × 204813.5 × 13.527.6 × 62.2
马可尼
CCD 48-20
1028 × 103313 × 1313.3 × 13.3
飞利浦
FTF3020-C
3072 × 204812 × 1236.8 × 24.6
飞利浦
FT18
1024 × 10247.5 × 7.57.68 × 7.68
表 2

慢扫描 CCD 相机还允许读取感兴趣区域。这意味着可以显示图像的选定部分,而丢弃剩余的累积电荷。成帧率通常随着检测区域尺寸的减小而增加。例如,传感器尺寸为 1000 × 1000 且输出速率为 10 帧/秒的 CCD,如果读出区域减少到 100 × 100 个二极管,则可以产生 100 帧/秒。通过权衡视野和帧率,调查人员可以适应比固定帧率摄像机更广泛的实验环境。

荧光的低光级成像

由于存在氧气时荧光染料的光破坏问题(“光漂白”)以及单个区域中可能涉及的荧光染料数量的限制,因此在荧光显微镜中使用了多种灵敏的电子检测器。在典型的落射荧光显微镜中,只有大约 5-10% 的激发荧光染料发出的光被收集并传输到传感器。有两种方法可以尽可能多地捕获这种有限的光通量如前所述,通过慢速扫描 CCD 进行集成,或在视频速率或逐行扫描 CCD 相机上进行图像增强和捕获。一般的发现是,如果有足够的积分时间,冷却的慢速扫描 CCD 相机总是比增强的 CCD 产生更高的信噪比。

图像增强器(参见图 9 到 11 中的示例)是为军事用途而开发的,以增强我们的夜视能力。它们有一个输入光电阴极,然后是一个微通道板电子倍增器和一个磷光输出屏幕。最新一代这些设备中的光电阴极与光电倍增管中的光电阴极相似,但在光谱的蓝绿色端具有更高的量子效率(高达 50%)。微通道板的增益可在较宽的范围内调节,典型最大值约为 80,000(输入处检测到的光子导致来自荧光屏的 80,000 个光子脉冲)。磷光体与眼睛的光谱灵敏度相匹配,通常不适合 CCD。增强型 CCD 的分辨率取决于增强器和 CCD,但通常受增强器微通道板几何形状的限制,仅为 CCD 的 75% 左右。最新一代的图像增强器(表示为蓝色加 Gen III 或有时表示为 Gen IV;图 9)采用比以前型号更小的微通道(直径 6 微米)和更好的填充几何形状,从而显着提高了分辨率并消除了鸡-线固定模式噪声困扰早期的设备。

与慢扫描 CCD 相机相比,图像增强器具有减小的场景内动态范围,并且难以从增强型 CCD 相机获得超过 256 倍的强度范围(8 位)。可以快速且可重复地改变增强器增益以适应场景亮度的变化,从而增加场景间动态范围。实际上,由于图像增强器可以快速门控(在几纳秒内关闭或打开),因此可以通过减少“开启”时间来可视化相对明亮的物体。具有 12 个数量级动态范围的门控、可变增益增强型 CCD 相机可在市场上买到。门控,

来自光电阴极的热噪声以及来自微通道板的电子倍增噪声将增强型 CCD 相机的信噪比降低到慢扫描 CCD 的信噪比以下。这些组件对光子通量统计特性产生的噪声的贡献取决于器件的增益和光电阴极的温度。通常,虽然增强型 CCD 相机可用于冷却光电阴极,但会采用降低增强级增益来限制噪声。

增强型 CCD 相机具有非常快的响应,受限于输出磷光体的时间常数,通常 CCD 相机的读出是图像采集中最慢的步骤。由于结合到活细胞或活细胞内的荧光染料发出的光通量低,因此经常采用增强型 CCD 相机来研究动态事件和离子敏感荧光染料的比率成像。比率成像需要同时或近乎同时采集不同激发或发射波长的两个图像,并且增强型 CCD 相机具有必要的速度和灵敏度。

电子轰击电荷耦合器件

探索光电子如何加速到电子轰击 CCD 中背照式电荷耦合器件的表面。

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图像增强器和 CCD 相机的混合体是最近推出的电子轰击 CCD(EBCCD;图 10)。在该设备中,光子由类似于图像增强器中的光电阴极检测。释放的电子在间隙中加速并撞击 CCD 的背面。这些高能电子在 CCD 中产生多个电荷,导致几百个适度的增益。与冷却的慢速扫描 CCD 相比,该设备的优势在于额外的增益和伴随的速度;主要缺点是光电阴极的量子效率较低和动态范围减小。与增强型 CCD 相比,电子轰击 CCD 通常在中等光照水平下具有更高的空间分辨率和更好的信噪比,SIT(硅增强器目标;图 11)相机。

电子与视觉检测

人眼与电子探测器相比如何?图 6 说明了眼睛的光谱灵敏度曲线,分别对应于视锥和视杆(图 12)产生的明视觉和暗视觉。峰值灵敏度为绿色(明视觉在 555 纳米,暗视觉在 507 纳米),明视觉的最大量子效率为 3%,暗视觉为 10%。我们的空间分辨率并不统一,因为锥体分布不均匀。最高密度出现在中心凹,锥体之间的距离约为 1.5 微米,这给了我们 5 到 6 微米的视网膜空间分辨率限制。在消色差(黑白)恒定照明条件下,视觉场景内动态范围只有约 50 倍(6 位)。我们的视觉色素,视紫红质,表现出很小的热噪声,暗适应后的最小可检测信号在瞳孔处约为 100 至 150 个光子或在视网膜处约为 10 至 15 个光子。眼睛在视觉检测极限处的信号/噪声约为 3: 1. 高光下延迟约 20 毫秒,暗光下延迟约 100 毫秒。

很明显,与我们的眼睛相比,科学级 CCD 相机具有更广的光谱灵敏度、更高的量子效率、更强的集成能力、更均匀、更好的场景内动态范围(更多“比特”)、可比或更高的信号/噪声,但空间分辨率较低。当与我们的视觉系统相匹配时,低光级相机在光子有限的条件下具有更宽的光谱范围、更少的延迟和更高的灵敏度和分辨率。

选择合适的相机

没有一个检测器可以满足荧光显微镜的所有要求,研究人员经常被迫妥协。此外,选择变得困难,因为慢速扫描相机越来越快,而视频速率相机通常会冷却。

当时间是关键参数时,增强型摄像机通常是唯一的选择。如果正在调查的事件快速但可以精确触发,则在突发或高速模式下运行的慢速扫描 CCD 可能是合适的。然而,当事件不容易预测并且必须在低入射光通量下连续监测样本时,增强型 CCD 是首选的检测器。出于这个原因,单分子荧光研究经常采用增强型 CCD 相机。

当有时间进行图像集成时,慢扫描 CCD 相机通常在所有领域都优于增强型相机,这在很大程度上是由于其更高的量子效率和更低的噪声。虽然当积分时间为几秒或更短且数字化级别为 10 至 12 位或更小时,冷却始终可以提高相机性能,但差异可能并不明显。对于涉及数字去卷积的应用,选择的检测器是能够产生高分辨率、14 位到 16 位图像的冷却、科学级、慢速扫描相机。然而,一些最新的 CCD 像素非常小,必须限制积分周期以避免孔饱和,因此动态范围和峰值信噪比可能不比增强型 CCD 好.

两种类型的彩色 CCD 相机用于科学应用带波长选择滤光片的单个 CCD 或三传感器(三芯片)相机。两者都使用过滤器来产生视场的红色、绿色和蓝色版本。单传感器相机利用粘附滤光片、滤光轮或液晶可调滤光片来获取红色、绿色和蓝色图像。当使用可调滤光片或滤光轮时,必须依次获得三个图像。三传感器相机具有分束棱镜和微调滤光片,使每个传感器能够成像适当的颜色并同时获取所有三个图像。由于额外的分束和波长选择组件,彩色相机始终不如单色相机敏感。在某些应用中,特别是免疫荧光,能够同时捕获多个波长可以抵消灵敏度的损失。此外,一些彩色相机通过采用压电控制的易位机制来稍微偏移 CCD,从而提高采样频率,从而获得更高的分辨率。

CMOS 相机性能的最新改进预示着这些设备在荧光显微镜中的潜在重要未来作用。CMOS 相机具有与集成片上格式中的每个光电二极管相关联的放大器和数字转换器。与每个像素关联的单个放大器有助于降低噪声和失真水平,但它们也会引起称为“固定模式噪声”的伪像,这种伪像是由单个像素放大器的开关和采样伪像引起的。这体现在由 CMOS 有源像素传感器设备生成的图像中“斑驳”行为的可再现模式。为解决这个问题已经投入了大量的研究工作,最近 CMOS 传感器中的残留噪声水平已显着降低。结果是便宜、紧凑、多功能检测器结合了硅检测的优点而没有电荷转移问题。CMOS 传感器允许对单个光电二极管进行增益控制、感兴趣区域读出、高速采样、电子快门和曝光控制。它们具有非凡的动态范围以及计算机接口的理想格式。在不久的将来,它们很可能会在许多科学应用中取代 CCD 相机。