奥林巴斯显微镜的DIC(微分干涉)观察方式

2021-11-11 09:39:20 admin 17

显微镜的各种观察方式中,DIC观察方式比较特别。

在 1950 年代中期,一位名叫 Georges Nomarski 的法国光学理论家修改了用于检测样本中的光学梯度并将其转换为强度差异的 Wollaston 棱镜。如今,这种设计有多种实现方式,统称为微分干涉对比 ( DIC )。活的或染色的标本在明场照明下观察时通常会产生较差的图像,通过光学而不是化学方法使其清晰可见。

在透射光 DIC 中,来自灯的光通过位于台下聚光器下方的偏振器,其方式类似于偏振光显微镜光路中的下一个(但仍位于聚光器下方)是一个改进的沃拉斯顿棱镜,它将入射的偏振光束分成两束以略微不同的方向传播。沃拉斯顿棱镜由粘合在一起的两个石英楔组成,从这些石英楔中发出的光线相对于彼此以 90 度振动,并具有轻微的光程差。不同放大倍数的每个物镜都需要不同的沃拉斯顿棱镜。沃拉斯顿棱镜通常安装在聚光镜上的旋转转塔中,这允许显微镜师在改变放大倍数时将适当的棱镜旋转到光路中。

沃拉斯顿棱镜波前

检查沃拉斯顿棱镜如何将偏振光束分裂或剪切成在相互垂直的方向上定向的普通光线和非常光线。

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平面偏振光仅在与光束传播方向垂直的一个方向(东-西)上振动,进入分束改进的沃拉斯顿棱镜并被分成两束相互垂直振动的光线。这两条光线靠得很近,但方向略有不同(见图 2)。光线在聚光镜的前焦平面处相交,在那里它们平行且非常靠近地通过,并有轻微的光程差,但它们彼此垂直振动,因此不会造成干扰。射线之间的距离,称为剪切,非常微小,小于物镜的分辨能力。

分裂光束进入并穿过试样,在那里它们的波路径根据试样的不同厚度、斜率和折射率而改变。这些变化会导致通过任何靠近在一起的样品细节区域的两束光束的波路径发生变化。当平行光束进入物镜时,它们会聚焦在后焦平面上方,然后进入第二个改进的沃拉斯顿棱镜,该棱镜将两束光束在棱镜外部的定义距离处合并。这消除了梁对之间的剪切和原始路径差异。由于已经穿过样品,平行光束的路径对于样品的不同区域的长度不同(光程差)。

为了使梁发生干涉,必须将不同路径长度的梁的振动带入同一平面和轴中。这是通过在上 Wollaston 光束组合棱镜上方放置第二个偏振器(分析器)来实现的。然后光线射向目镜,在那里可以观察到强度和颜色的差异。该设计导致细节的一侧显得明亮(或可能是彩色),而另一侧显得较暗(或另一种颜色)。这种阴影效果赋予样本伪三维外观。

在某些显微镜中,上部改进的沃拉斯顿棱镜与集成在其上方的分析仪组合在一个单一的配件中。上棱镜也可以布置成可以水平移动。这允许通过移动棱镜来改变光程差异,为用户提供一种机制来改变背景和样本的亮度和颜色。由于棱镜的设计和位置,无论选择何种颜色,背景都是同质的。

微分干涉对比度

探索改变上 Wollaston 棱镜中的偏差如何影响 DIC 显微镜中的图像对比度。

图像中显示的颜色和/或光强度影响尤其与折射率、样品厚度或两者的变化率有关。试样的方向会对浮雕状外观产生明显的影响,通常,将试样旋转 180 度将山丘变成山谷,反之亦然。三维外观并不是样品真实几何性质的表示,而是基于光学厚度的夸大。不适合准确测量实际高度和深度。

与相差显微镜相比,DIC 显微镜有许多优点。使用 DIC,可以更充分地利用系统的数值孔径并提供光学染色(颜色)。DIC 还可以让显微镜获得出色的分辨率。使用全物镜孔径使显微镜能够聚焦在厚标本的薄平面部分,而不会混淆平面上方或下方的图像。DIC 图像中不存在相衬中经常遇到的令人讨厌的光晕,而合适的消色差物镜和萤石物镜可用于这项工作。

一个缺点是塑料组织培养容器和其他双折射标本在 DIC 中产生令人困惑的图像,因此建议将霍夫曼调制对比度用于组织培养工作。此外,现在设计了适用于 DIC 的高质量复消色差物镜。图 3 展示了苍蝇口器的透射和反射光 DIC 显微照片(透射 DIC;图 3(a))和铁硅合金中的表面缺陷(反射 DIC;图 3(b))。两张显微照片均使用具有 10 倍物镜的延迟板制作。

DIC 显微镜所需的设备包括偏振器、聚光镜下方的分束改良沃拉斯顿棱镜、物镜上方的光束重组改良沃拉斯顿棱镜以及该上部棱镜上方的分析器。聚光镜下方需要单独的棱镜(对于每个物镜)(图 4)。对于上棱镜,单个棱镜可用于所有物镜。上棱镜可以横向移动。

下棱镜相对于聚光镜前焦平面的放置距离以及上棱镜与物镜后焦平面的距离非常关键。因此,制造商指定他们的哪些目标适合他们特定的 DIC 设备。

DIC 聚光镜包含四个或更多棱镜、一个带孔径光阑的明场开口,用于常规明场工作,和/或几个光环。光环与相位物镜一起使显微镜师能够在相位对比和 DIC 图像之间进行快速比较。棱镜下方装有可旋转的偏振器。使用全物镜光圈可以聚焦厚样品的薄平面部分,而不会混淆被聚焦平面上方或下方的图像;这称为光学切片更大的孔径在光学显微镜中也能产生更好的分辨率。

图像中显示的颜色和/或光强效应尤其与样本的细节或相邻区域的折射率厚度或两者的变化率有关图像显示为 3 维。这种外观并不代表试样的真实几何性质,而是基于光学厚度的夸大,不适合准确测量实际高度和深度。光学厚度是指由于折射率或实际厚度的变化或这两个变量的某种组合而导致的光路变化。

如上所述,在可移动上棱镜的灰度设置下,3维最显着。试样的方向可以显着改善浮雕状外观。有时,样品旋转 180 度会将山丘变成山谷,反之亦然;因此,必须谨慎地解释图像。细节一侧较暗的外观和另一侧较亮的外观通过提供伪浮雕效果极大地提高了可见性。

要配置 DIC 对比度增强显微镜,应考虑以下步骤:

  • 将 DIC 聚光镜放入显微镜的台下聚光镜支架中,并将 DIC 沃拉斯顿棱镜安装到开槽物镜或每个物镜后面的插槽中。使用 10X 物镜和位于明场 ( 0 ) 位置的聚光镜和光路中的偏振器,在舞台上放置样品,设置科勒照明。将样品移出光路并取下目镜之一。

  • 将相位聚焦望远镜插入目镜筒中,在观察物镜后焦平面的同时,旋转上棱镜的螺丝,直到看到物镜后部中心出现一条对角黑线。现在稍微旋转台下偏振器,使黑线尽可能地呈现黑色。这实际上是在调整偏振器,使其与位于上棱镜上方的检偏器交叉(以 90 度角)。确保聚光器孔径光阑打开到物镜后透镜直径的 2/3 到 4/5。

  • 取下调焦望远镜并将常规目镜放回目镜筒。旋转聚光转盘,将合适的下棱镜带入光路;这通常由炮塔上的红色或白色10设置标记将样品移回光路。现在您可以使用上棱镜的旋钮将其横向来回平移以获得所需的效果或颜色。您也可以旋转载物台来改变样品的方向以改善效果。

  • 对所使用的每个物镜都采取类似的步骤,通过调整视场和孔径光阑,确保依次为每个物镜正确配置显微镜以进行科勒照明。

与相位显微镜相比,DIC 显微镜具有许多优势:

  • 可以更充分地利用系统的数值孔径,因为与相差显微镜不同,没有台下环来限制孔径;科勒照明得到适当利用。

  • 没有相位图像中可能遇到的令人困惑的光晕。

  • 可以看到具有醒目的颜色(光学染色)和 3 维阴影样外观的图像。轮廓和细节的可见度大大提高,这些图像的显微照片在色彩和细节上都引人注目。

  • 如果制造商声明此类物镜是为其设备设计的,则可以使用常规平面色差或消色差(也适用于普通明场工作)。

DIC 有几个缺点或限制:

  • 由于需要许多棱镜,DIC 的设备非常昂贵。

  • 双折射样品(例如在多种晶体中发现的样品)可能不适合,因为它们会影响偏振光。同样,由塑料制成的标本载体,例如培养容器、培养皿等,可能不适合。对于此类标本,霍夫曼调制对比度可能是更好的选择。

  • 对于非常薄或分散的样本,使用相衬方法可以获得更好的图像。

  • 复消色差物镜可能不适合,因为此类物镜本身可能会显着影响偏振光。

再一次,像许多对比增强技术一样,我们发现在聚光镜的前焦平面和物镜的后焦平面处对光的操纵对通过目镜可视化的图像的外观有显着影响.