显微镜光源的反射光原理剖析

2021-11-02 10:05:13 admin 16

显微镜的观察方式中,有透视和反射俩种比较常用的照明方式,今天我们就来讲讲显微镜反射光。

在明场反射光显微镜中,正确使用图 1 所示的两个可变光阑,孔径可变光阑(靠近光源)和视场可变光阑(靠近样品),可以使用非常理想的科勒照明.

这些光阑在透射光中与它们各自的位置相反,孔径光阑现在更靠近光源。这种照明提供了均匀分散在聚焦标本的视野平面上的明亮光线。 科勒照明利用物镜数值孔径的最大份额提供无眩光,并具有良好的对比度和分辨率。

需要注意的是,在这些反射光系统中,物镜具有双重功能:在下降过程中作为匹配良好校正的聚光镜正确对准;在作为成像物镜的过程中,物镜的惯用作用是将携带图像的光线投射到目镜上。在透射光系统中,更换物镜需要调整聚光镜的数值孔径以匹配新物镜的数值孔径。然而,在反射光中,物镜和聚光器的数值孔径会随着新的物镜同时变化。共轭平面类似于那些描述的透射光,光源的图像形成在物镜的后焦平面和孔径光阑虹膜开口内。

反射光照明器

探索如何调节电压以控制反射光照明器中卤钨灯的照明强度。

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科勒照明的一个功能(除了提供均匀分散的照明)是确保即使光源是线圈灯丝灯,物镜也能够提供出色的分辨率和良好的对比度。孔径可变光阑控制从明场反射光中完整锥体中每个方位的光照射到样品的角度。物镜的数值孔径决定了从样品反射时可以“捕获”的光的角度。在其他因素相同的情况下,数值孔径越高,物镜的分辨率就越好,即物镜能够更好地分离靠近在一起的小细节。系统'

在科勒照明中,系统的布置(图 2)使灯的线圈灯丝的图像在孔径可变光阑平面上聚焦;它也在物镜的后焦平面上聚焦。假设照明器的光路中没有磨砂滤光片,当取下目镜时,可以在物镜的背面看到灯丝的图像。在大多数系统中,灯罩外部有一组定心螺钉(图 3),您可以通过沿南北或东西方向移动灯丝来使灯丝居中。此外,如上所述,在物镜的后焦平面处可以观察到孔径可变光阑的关闭或打开。

视场虹膜光阑与聚焦标本、目镜固定光阑平面处的中间图像平面和眼睛的视网膜共轭(预聚焦)。

反射光显微镜越来越受到人们的关注,尤其是在其在荧光显微镜越来越有用快速发展的半导体行业也导致反射光显微镜的使用增加,反射光显微镜在金相学、矿石岩相学和材料研究等经典应用中仍然非常有用。

在实践中,样品首先用中等放大倍数的物镜聚焦,通常是 10 倍,并且预聚焦视场光阑的孔径是关闭的,直到它在视野的外围可见。如果视场可变光阑未居中,则使用垂直照明器上的定心螺钉将部分关闭的光圈开口移动到视场中心。然后打开光圈,直到它从视野中或从显微照相分划板中胶片框所描绘的区域中消失。接下来,将灯丝居中并聚焦(如果这在工厂尚未完成),并设置孔径光阑以获得最佳的样品对比度和图像质量。这些步骤将在以下各节中详细讨论。


科勒照明反射光显微镜的调整

目镜和视场光阑

  • 选择具有高度反射率的样品,以在初始科勒照明配置步骤中最大限度地增加反射回物镜的光量。理想的选择是高反射硅上的集成电路、高度抛光的金属部分或光滑的金属薄膜。标本应具有一定程度的细节或纹理,可用于找到标本的焦平面。

  • 将反射样品放在舞台上并激活光源,该光源通常是位于灯罩中的卤钨灯泡,类似于图 3 所示的灯罩。旋转物镜转盘以放置中等功率的物镜,例如 10x,面对标本。如果灯泡工作正常,物镜应将直径约 3 毫米的小圆圈投射到样品表面。

  • 在观察物镜和样品时,使用粗调焦旋钮升高载物台,直到它位于物镜前透镜下方几毫米处。小心不要将样品驱动到物镜前透镜中。接下来,在通过目镜观察样品的同时,用(首先)粗调焦旋钮和细调焦旋钮慢慢降低载物台,直到样品细节变得清晰。如果错过了焦点,重新开始时,物镜前透镜和样品之间的距离略小。在许多情况下,如果标本在试图建立焦点时移动,则更容易找到正确的焦点。通过旋转圆形 360 度载物台或使用机械载物台旋钮在视场中来回平移样品来完成此操作。

  • 一旦标本处于清晰焦点,调整双目显微镜瞳距。 此时还应调整每个目镜的屈光度

  • 许多偏光和微分干涉对比 (DIC) 显微镜都配备了圆形刻度平台,可围绕显微镜的光轴旋转整整 360 度。这些显微镜通常为每个物镜配备单独的调整装置(通过物镜转盘中的固定螺钉),以使物镜的光轴与显微镜的光轴同心。在继续之前进行此调整是个好主意。

  • 下一步是调整视场光阑,它是最靠近显微镜前部的虹膜光阑,如图 4 所示。有时光阑标有“ F ”或“视场”" 直接在照明器外壳上。使用调节杆关闭视场可变光阑,直到您开始在视场中看到叶子。继续关闭光阑直到调节杆停止的位置,在目镜中只能看到一个小开口. 样品和光阑叶片都应清晰对焦,通常在工厂进行设置,因为大多数现代反射光显微镜都没有配备允许调节视场光阑的轴向位置(不能对焦) ). 这是因为物镜兼有聚光镜的双重作用,因此出厂时已预设了临界焦平面,以最大程度地减少显微镜对准误差。在大多数情况下,视场光阑的焦点和中心之间会存在细微差异在不同的目标中,但这种微小的波动通常可以忽略不计。

  • 一组定心旋钮位于垂直照明器的外壳上靠近视场光阑,允许用户将视场光阑居中。使用这些旋钮将视场光阑图像居中,然后慢慢打开虹膜叶,直到光阑图像刚好在视场之外。如果显微摄影是首要考虑因素,则视场光阑的打开宽度应仅足以让胶片框架中的轮廓区域(刻在显微摄影标线中)可见。更换物镜不需要调整视场光阑尺寸设置,因为新的物镜也将作为聚光镜,两者之间的关系将保持不变。这很容易通过将视场光阑关闭到与显微照相或测量标线相关的预定尺寸来验证。

灯丝对齐和孔径调整

  • 正如透射光中的科勒照明一样,反射光中(“聚光镜”)孔径光阑的调整对于控制样品对比度、减少衍射和眩光伪影以及产生最佳图像质量至关重要。灯丝的图像应聚焦并完全充满孔径光阑,类似于透射光的情况。

  • 第一步是使灯丝居中和聚焦。一些现代反射光显微镜(尤其是高端研究型号)在外壳中配备了一个预居中的卤钨灯,该灯还配有聚光透镜和漫射屏。没有对这些系统进行调整,但许多较旧的落射照明系统的灯必须居中,并且为此提供了调整机制。第一步是去除(如果可能)在视场上均匀分布照明的玻璃扩散过滤器。接下来,使用调节旋钮(见图 3)将灯丝居中,同时观察物镜后焦平面中的共轭图像。这以类似于透射光显微镜的方式完成,其中目镜被移除,聚光镜孔径和灯丝图像通过目镜在物镜的后焦平面上观察。欢迎参观者和学生在以下交互式 Java 教程中探索灯丝对齐:

灯丝对齐

练习对准和聚焦灯丝,然后在物镜的后焦平面观察其图像。

  • 当目镜从眼管上取下时,在物镜的后焦平面上应该可以看到灯丝(清晰对焦)的图像以及部分关闭的孔径光阑。这种观察可以通过使用相位望远镜、伯特兰透镜(通常在偏光显微镜上找到的附件)或通过中心有针孔的端盖来促进。后者可以由目镜塞制成,用于在运输过程中保护显微镜的内部。如果毛玻璃漫射屏尚未(或无法)移除,则应出现均匀照明的光盘来代替灯丝线圈。如果灯丝未居中,灯盘上会出现“热点”,可通过调整灯箱上的螺丝来解决(图3)。

  • 最后一步是调整孔径光阑的开度,通常用垂直照明器外部的字母“ A ”或“ Aperture ”字样来标识透射光显微镜,每次将不同数值孔径的新物镜插入光路时,必须重新调整聚光器孔径光阑。这是因为物镜和聚光镜是独立的实体,改变物镜数值孔径不会影响聚光镜。为了补偿,聚光器孔径光阑必须打开或关闭,以提供与物镜数值孔径相匹配的照明光锥。However, in reflected light microscopy the objective also acts as the condenser (as discussed above, providing both illuminating and image-forming light pathways), and the numerical apertures change accordingly when a new objective is selected.

聚光镜光圈调节

了解如何最大化图像对比度以及在调整聚光器孔径光阑期间如何出现衍射伪影。

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  • 确定孔径光阑的正确设置对于获得没有衍射伪影、具有足够对比度和最高质量的图像至关重要。通常,这是由于在最大化图像对比度而不引入由于折射和衍射而导致的错误伪影之间达成折衷的折衷结果。如上所述,孔径光阑必须随着透射光显微镜中的每次物镜变化而重置。然而,在反射光显微镜中,物镜和“聚光镜”随着数值孔径的同时增加而变化,并且可以为孔径光阑选择单一设置。此设置通常在 60% 到 95% 之间打开,但会因样品而异,并且在很大程度上取决于样品的反射率。高反射样品需要较小的光圈以减少眩光和增强对比度,但这最好根据具体情况进行。最好的程序是首先将光圈打开到最大设置,然后在观察样本时慢慢关闭以优化对比度。在显微摄影中,“括号”一组显微照片通常是明智的,每张照片的孔径大小略有不同。

上面概述的明场反射光显微镜技术也适用于配备交叉偏振、荧光和微分干涉对比 (DIC) 的显微镜事实上,在任何这些模式下,显微镜都可以针对科勒照明进行调整,而且对比度增强通常可以互换,而无需重新调整显微镜照明。