如何理解显微镜的霍夫曼调制对比基础

2021-09-03 09:44:19 admin 16

什么叫做霍夫曼调制?咋样来做霍夫曼调制对比?其实,霍夫曼调制是Robert Hoffman 博士发明的。

霍夫曼调制对比度系统旨在通过检测光学梯度(或斜率)并将其转换为光强度的变化来提高未染色和活体材料的可见度和对比度。该技术由 Robert Hoffman 博士于 1975 年发明,并采用了适用于许多商用显微镜的多种配件。

霍夫曼调制对比度的基本显微镜配置如图 1 所示。 一个光学幅度空间滤波器,被霍夫曼称为“调制器”,插入在消色差或平消色差物镜的后焦平面上(尽管也可以使用更高的校正) . 通过该系统的光强度在平均值上下变化,根据定义,该平均值被称为已调制。用于调制对比度的物镜可以覆盖 10 倍到 100 倍的整个放大范围。调制器具有三个区域,如图 2 所示:靠近后焦平面外围的一个小的暗区,它仅透射 1% 的光(图 2 中标记为“ D ”的区域);G " 图 2);以及剩余的清晰或透明区域,覆盖物镜背面的大部分区域,可透射 100% 的光(标记为“ B 的区域”)" 在图 2 中。与相差显微镜中的相位板不同,霍夫曼调制器的设计不会改变通过任何区域的光的相位。在调制对比度光学系统下观察时,在普通明场中基本上不可见的透明物体显微镜呈现出由相位梯度决定的明显的三维外观。调制器不会改变通过调制器不同部分的光的相位关系,但会影响主要的零阶最大值。更高阶衍射最大值不受影响。测量使用迈克尔逊干涉仪确认通过霍夫曼式调制器的光的相变变化(如果有)小于 λ/20。

在舞台下方,带有旋转转塔的聚光镜用于固定霍夫曼调制对比度系统的其余组件。转塔聚光镜有一个明场开口,带有孔径可变光阑,用于常规明场显微镜和对准和为显微镜建立适当的科勒照明条件。在其他每个转塔开口处,都有一个偏心的狭缝,部分覆盖着一个小的矩形偏振片。对于不同放大倍数的每个物镜,狭缝/偏振器组合的尺寸是不同的;因此需要炮塔布置。

霍夫曼设计的狭缝位于聚光镜的前焦平面,如图 1 和图 3 所示。当光通过离轴狭缝时,它在物镜的后焦平面上成像(也称为安装了调制器傅立叶平面)。包含离轴狭缝板的聚光器的前焦平面与物镜后焦平面中的调制器光学共轭。图像强度与样品中光密度的一阶导数成正比,并由相位梯度衍射图案的零阶控制。

调制对比度的原理提供了图2和3中所示的至少两种基本调制器狭缝板配置。为了本讨论的目的,图2中所示的调制器板的图被夸大并增大了尺寸。图 2 和图 3(图 2(a) 和图 3(a))左侧的排列是一个对称系统,其中调制器灰色条纹和狭缝都放置在显微镜的光轴(中心)上。本系统中的分辨率仅限于:

分辨率 = λ / NA

其中NA是物镜的数值孔径,λ等于成像光源的波长平均值。深色(1% 透射率)和浅色或透明(100% 透射率)区域的大小相同,而灰色(15% 透射率)区域呈窄条纹形式,为出瞳直径的 10%的目标。另一种布置(图 2 (b) 和 3(b))是不对称或偏移的,其中调制器的暗区位于物镜的出瞳之外。该系统中的分辨率大大提高,并接近:

分辨率 = λ / 2 (NA)

其中NAλ 的上述相同。很明显,偏移系统(图 3(b))的分辨率几乎是中央(图 3(a))系统的两倍。偏移系统中的透明(清晰)区域几乎填充了物镜出瞳直径的 90%,灰色和暗区填充了其他 10%。

在聚光镜下方,在显微镜的出光口上放置了一个圆偏光片(注意两个偏光片都在下方标本)。这种偏光片的旋转可以控制狭缝开口的有效宽度。例如,两个偏振器相互“交叉”成 90 度会导致狭缝“变窄”,使其图像落在调制器的灰色区域内,如图 3 所示。狭缝的一部分由偏光器记录在调制器的明亮区域。当偏光器旋转时,对比度可以改变以获得最佳效果。非常窄的狭缝产生的图像对比度非常高,相干度适中。当狭缝调整到最窄位置时,光学切片成像也得到了优化。当圆偏振片的振动方向与狭缝中偏振片的振动方向平行时,有效狭缝宽度最大。

调制对比度系统的早期设计没有在显微镜光端口上使用狭缝偏振器或圆偏振器,而是依靠如图 4 所示的单一尺寸狭缝来实现对称配置。在该图中,来自光源的光通过一个固定孔径的狭缝(图中称为“狭缝板”),然后通过一个包含相位梯度的样本。这些梯度根据梯度的方向将光偏转到位于物镜后焦平面的对称调制器的清晰或暗区。生成的图像显示一个简单的对比度梯度,该梯度由样品中相位梯度的位置和斜率决定。



在现代先进的调制对比度系统中,调制器和狭缝都偏离显微镜的光轴。这种安排允许更充分地利用物镜的数值孔径,并产生良好的分辨率和细节。形状和细节以阴影、伪三维外观呈现。在灰色背景下,它们在一侧看起来更亮,在中央部分呈灰色,在另一侧看起来更暗。调制器将光学相位梯度的细节(陡度、斜率、折射率变化率或标本细节的厚度)转换为目镜光阑平面处图像各个区域的强度变化。生成的图像具有明显的三维外观,对光学梯度具有方向敏感性。

相反的梯度导致狭缝图像偏转到调制器的非常暗的部分或调制器的亮部分,如图 5 所示。在该图中,假设样本包含正相位(厚度)梯度和使用调制对比度光学组件对平坦(非梯度)区域进行成像。图 5(a) 中描绘的负梯度将光偏转到调制器的暗区,在那里它衰减到其先前值的大约 1%。同样在图 5(c) 中,通过正梯度偏转到调制器的清晰区域的光没有衰减,并且该光的 100% 被传输到中间图像平面。样本的任何非梯度部分(图 5(b))以及背景(环绕)在调制器的灰色部分注册,其中大约 15% 的光传输到中间图像平面。结果是梯度一侧的图像区域的强度变暗。梯度另一侧的强度产生明亮的图像区域,非梯度区域在图像上显示为灰色,背景也是如此。

暗区和亮区与灰色的对比(与强度变化有关)提供了阴影的伪浮雕效果。这是调制对比成像的典型特征。偏振器的旋转会改变所达到的对比度,并且样品台上的样品方向(相对于偏振器和偏移狭缝)可能会显着提高或降低对比度。

由于调制器根据试样的细节如何改变狭缝图像(从而导致改变光强度)来影响狭缝图像,因此它被描述为幅度滤波器。 霍夫曼和其他人已经证明,样品中的相位梯度,如空间频率,分布在物镜的整个出瞳上。调制器的光传输强度分布将为产生相位梯度的各种物体提供令人满意的图像,包括:所有类型的细胞和组织(活的、染色的和未染色的),以及晶体、透明聚合物、玻璃的表面细节和其他类似材料。反射光调制对比显微镜也可用于对不透明和冶金样品中的晶界以及复杂集成电路和其他电子材料的表面细节进行成像。

调制对比度有许多优点和局限性。一些优点包括更充分地利用物镜的数值孔径,产生出色的细节分辨率以及良好的标本对比度和可见性。尽管许多标准调制对比度物镜是消色差或平消色差物镜,但也可以使用具有更高光学像差校正度的物镜,如上所述。许多主要的显微镜制造商现在提供萤石校正等级的调制对比度物镜,并且可以通过特殊订单获得复消色差。旧物镜通常可以用调制光学公司制造的调制器进行改装,该公司由罗伯特霍夫曼博士创立,专门用于构建售后市场和定制系统。

除了使用具有调制对比度的更高数值孔径的优势外,还可以进行“光学切片”景深被定义为从一个层次到下一个层次的距离,其中发生明显的细节成像,并且由物镜的数值孔径控制。数值孔径较高的物镜表现出非常浅的景深,而数值孔径较低的物镜则相反。随着样品光学均匀性的降低,物镜隔离和聚焦特定光学截面的整体能力会减弱。

图像呈现阴影或伪三维,由于细节两侧的对比度差异而增强了可见性。与相差光学产生的图像不同,图像中没有出现光晕。调制对比度将相位梯度信息转换为振幅差异,该差异与相差显微镜产生的相位关系变化(和光程差异)非常不同。调制器中暗区和灰色区的使用产生包含不同灰度阴影且没有颜色的图像。可以通过生产具有灰色和暗区代替具有相等透射率值的彩色区的调制器来将颜色引入调制对比度图像中。在这种情况下,来自相位梯度的结果图像以具有相同色调的相似梯度的颜色呈现。目前,我们不知道任何包含彩色区域的调制滤波器的商业来源。

霍夫曼调制对比度

探索如何通过这种独特的显微镜技术提高可见度和对比度。


消色差或平面色差是调制对比度显微镜使用最广泛的物镜,因为它们可以产生良好的图像,因为不涉及颜色。将这些物镜与绿色滤光片(放置在偏振器下方)一起使用将进一步改善图像,因为消色差是针对绿光进行球面校正的。更高校正的物镜,包括萤石和复消色差镜,也可用于调制对比度显微镜,但增加的费用通常不值得提高图像质量,除非在非常高的放大倍数下。

调制对比配件的成本远低于微分干涉对比 (DIC) 设备的成本。尽管这两种技术都需要具有与每个物镜匹配的组件的转塔聚光镜,但配备 DIC 的显微镜还包含一个位于聚光镜下方的偏振器和一个位于光路中中间图像平面之前(物镜上方)的分析器。DIC 显微镜所必需的交叉偏振系统的存在会降低其对偏振光起反应的样品的有效性。

双折射物体(岩石薄片、晶体、骨骼等)可能会混淆 DIC 中的图像,因为样品不在两个偏振器之间,因此可以进行检查此外,样品可以包含在塑料或玻璃容器中,而不会由于偏振效应而导致图像恶化,因为此类容器也位于两个偏振器上方,而不是它们之间。这使得霍夫曼系统在塑料容器中进行的细胞、组织和器官培养的检查和显微照相方面比 DIC 更有用。

当聚光镜设置在明场位置时,安装了调制器的物镜也可用于常规明场工作。因为调制器是离轴的,所以图像几乎没有劣化。配备调制器的物镜(但不是狭缝板聚光镜)也可用于荧光和暗场工作,但在尝试 DIC 显微镜时应避免使用这些物镜。调制对比度系统已非常成功地与偏振光显微镜一起使用,以增强对样品中光学梯度和双折射的检测。在此应用中,使用非偏振狭缝,偏振光配置应为平行偏振器(尽管交叉偏振器也会产生良好的结果,尽管照明会减弱)。

霍夫曼调制对比系统也有几个缺点和局限性。必须谨慎查看图像,因为不同的观察者可以将图像中的“山丘”“看到”为“山谷”,反之亦然,因为通过目镜观察伪三维图像。该系统对垂直于狭缝长度的梯度最敏感,因此需要一定程度的试样定向技巧才能获得最佳效果。

每个物镜和聚光镜开口的修改成本必须添加到这些配件本身的基本成本中。复杂的、高数值孔径的多元素物镜很难修改或修改成本太高。近年来,Robert Hoffman 的公司Modulation OpticsGreenvale, New York(Slant Fin Corporation 的全资子公司)一直在生产改进的物镜和聚光镜。Modulation Optics 专注于修改领先显微镜制造商生产的物镜。有些物镜很容易修改,而有些物镜很难或不可能根据调制光学规格进行修改。但是,任何物镜都可以与公司的中间管系统之一一起使用,包括从微距相机镜头到 100 倍显微镜物镜的广泛范围。此类别中还包括设计用于对干燥或浸入介质(油、水和甘油)的样品成像的物镜、单波长和多波长物镜、反射和透射光物镜,以及针对无限远或有限管长度校正的物镜。

除了使用包含半透明彩色滤光片代替灰色和暗区的特殊调制器观察到的样品外,非吸收性样品不会呈现颜色。自然吸收特定波长或轻微染色的样本会呈现颜色,以及通过调制对比度和荧光的组合或调制对比度和偏振光的组合观察到的颜色。

霍夫曼调制对比显微镜的配置非常简单,基本步骤概述如下:

透射光中的霍夫曼调制对比度

  • 将相关的调制对比度启用物镜连接到显微镜的物镜转盘上,并安装包含适当狭缝板的转塔聚光镜。如果显微镜配备微分干涉对比 (DIC) 或偏光显微镜,请从光路中移除所有偏光器、延迟板和 Wollaston 或 Nomarski 棱镜。

  • 将染色标本(最好是组织薄片)放在舞台上,并使用 10x 物镜(安装了调制器),将显微镜对准适当的Köhler 照明,如我们的显微镜解剖部分所述调制对比度狭缝板应从聚光镜中移除以进行此操作。如果转塔聚光镜有一个带有孔径光阑的明场照明位置,请旋转转塔以选择该聚光镜。

  • 查看物镜后焦平面中的调制器板,使用 Bertrand 透镜(在偏光显微镜上很常见)、相位望远镜,或者简单地取下目镜并向下凝视眼管。确保将样品从光路中取出或移至显微镜载玻片上的清晰区域。

  • 通过将适当的聚光镜(从转塔)移动到光路中,选择与 10x 物镜相对应的狭缝孔径板。应该有一组调整螺钉或杠杆,允许聚光镜内的照明狭缝板旋转和平移。

  • 将圆偏振滤光片放在聚光镜下方的显微镜光端口上。在通过伯特兰透镜(或相位望远镜)观察狭缝图像的同时旋转此滤光片,观察旋转角度影响通过狭缝偏振器部分的光量(亮度)。

  • 平移狭缝的图像,使没有偏振器的开放部分叠加在调制器板的灰色区域上,如图 3(b) 所示。包含偏振材料的狭缝部分应在灰色区域右侧的调制器的清晰部分成像。旋转圆偏振滤光片,观察包含偏振材料的狭缝区域如何出现和消失。当圆偏振器的振动平面垂直于狭缝中偏振器的振动平面对齐时,狭缝尺寸最小化,对比度最大。可以使用下面的交互式 Java 教程来练习此操作:

调制对比度狭缝对齐

使用本教程在霍夫曼调制对比系统中练习狭缝对齐。

通过这些信息,咱们对于显微镜的霍夫曼调制有没有新的认识和认知呢?如有需要,欢迎致电显微镜销售热线:021-51602084.期待您的光临。