暗场显微镜的各种配置和对应的校准步骤

2021-08-24 10:20:03 admin 3

  今天我们一起来学习暗场显微镜的各种知识,暗场显微镜的各种配置和对应的校准步骤。

以下部分回顾了显微镜的配置和校准步骤,用于低倍率和高倍率透射暗场照明。

低倍率透射暗场显微镜配置

  • 选择适合高对比度染色的标本,并将其放置在显微镜载物台上进行观察和显微镜校准。选择 10x 物镜,并通过明场照明使样品聚焦清晰。


  • 使用我们关于使用透射光显微镜科勒照明设置部分中概述的程序,仔细对齐显微镜的光学元件并调整光源和光阑以获得适当的科勒照明

  • 在进一步操作之前,将场和台下聚光器孔径可变光阑打开到完全打开的位置。这允许聚光镜以其最大数值孔径运行。选择合适的中央不透明挡块(对于 10 倍物镜,通常直径约为 16-18 毫米的挡块)并将其放置在蜘蛛网、玻璃或醋酸酯挡块支架上。接下来,将挡块组件插入显微镜的光路中,方法是将其滑入子聚光镜过滤器支架或将其粘贴到聚光镜下侧。

  • 如果要使用专为低倍率暗场照明设计的聚光镜,请将其插入显微镜配置这一点的台下聚光镜支架。

  • 取下目镜,通过向下凝视目镜筒或插入相位望远镜(或伯特兰透镜)来查看物镜的后焦平面。通常,在物镜后焦平面上可以看到被中央不透明光阑部分遮挡的明亮光盘。理想情况下,中央光阑直径应略大于亮盘并完全掩盖它。如果不是这种情况,请使用台下定心螺钉将聚光镜定心,使明亮的圆盘完全被中央挡块覆盖。

  • 更换目镜并在适合暗场照明观察的载物台上放置低对比度样品。标本的图像在非常暗的背景下应该是明亮的,唯一的伪影是显微镜载玻片上的小灰尘颗粒和污迹。如果图像太暗,请将卤钨光源的电压增加到其最大电压。

  • 聚焦聚光镜是最后一步,应特别注意,尤其是在使用放大倍数超过 20 倍的物镜时。聚光镜的顶部透镜(“干”使用时)应几乎与显微镜载玻片的底部接触。当聚光镜在机架中的位置太低时,视野中会明显出现一个被明亮光环包围的黑暗中心区域。这可以通过升高聚光镜直到在视野的中心部分完全照亮直径很小的明亮圆形区域来解决。

  • 显微镜现在可以在低放大倍数暗场照明下观察和显微照片。

高倍率透射暗场显微镜配置

  • 以类似于低功率暗场显微镜配置的方式,将染色标本放在舞台上,并使用 10 倍物镜,按照我们的透射显微镜部分所述,将显微镜准科勒照明

  • 使用聚光镜架旋钮降低并移除明场台下聚光镜。将反射光高数值孔径聚光镜插入支架,并用固定螺丝固定。缓慢升起聚光镜,直到距离载玻片底部不到 2 毫米。

  • 选择一个暗场标本并将其放置在物镜和聚光镜之间的显微镜载物台上。聚光镜将明亮的光环投射到样品上,可用于使光路居中。使用聚光镜平移定心螺钉将光环移动到视野中心。


  • 在居中高数值孔径暗场聚光镜时,使用低功率 10 倍物镜通常是有利的。当用 10 倍物镜观察样品时,同时缓慢升高和降低聚光镜,将到达一个点,在该点处,视场中将出现一个亮点,如图 2(a) 所示。当冷凝器稍微升高或降低时,如果冷凝器正确居中,则会出现类似于图 2(b) 中所示的黑点。在聚光镜没有正确对齐和居中的情况下,典型的视场可能如图 2(c) 所示,如果显微镜未针对科勒照明进行适当调整,则视场可能如图 2(c) 所示2(d)。冷凝器的理想和正确定位如图 2(a) 所示,

  • 高数值孔径暗场聚光镜设计用于“干式”或聚光镜顶部透镜和显微镜载玻片底部之间的浸油。要将油涂在浸没式聚光镜上,请取下显微镜载玻片,然后将聚光镜慢慢地放在机械载物台下方,然后将一滴油直接放在前镜头上。更换载玻片,然后慢慢升高冷凝器,直到油滴与载玻片底面接触。仔细观察油接触区域,以确定是否有任何气泡被引入到聚光镜顶部透镜和显微镜载玻片之间的空间中。需要注意的是,无论物镜的放大倍数是多少,如果使用无油的油浸式聚光镜,聚光镜不会出光。

  • 气泡会散射光,通过取下目镜并使用相位望远镜或伯特兰透镜观察物镜的后焦平面,可以观察到气泡。如果不存在气泡,则继续下一步。当检测到气泡时,清除载玻片和聚光镜顶部透镜上的所有油迹,然后重复该过程。在为冷凝器重新上油之前,确保两个表面都干净且完全没有油、灰尘、污垢和其他污染性工件。

  • 选择用于观察样品的物镜并将其摆动到聚光镜上方的位置。如果物镜设计为干燥使用,则通过调整聚光器聚焦旋钮聚焦样品并优化照明。对于油浸物镜,在将其摆动到位之前,在物镜的前透镜上滴一滴油。慢慢地将物镜移动到位,仔细观察物镜前透镜和显微镜载玻片之间的油接触区域。应发生明亮的闪光(来自散射光)物镜前透镜上的即时油与显微镜载玻片接触。

  • 通过用相位望远镜或伯特兰透镜观察物镜的后焦平面来检查气泡。如果存在气泡,将物镜摆动到显微镜物镜转盘上的下一个止动挡块,并用一块无绒镜头纸擦去多余的油。在物镜前透镜上重新涂抹油,然后再试一次。当油接触区域没有气泡时,使用聚光镜架聚焦旋钮优化暗场照明。

  • 如果物镜的内部可变光阑设计为允许调整数值孔径,则此时应进行调整(这仅适用于数值孔径高于 1.20 的油浸物镜)。取下目镜,将相位望远镜放入目镜筒或使用伯特兰透镜观察物镜的后焦平面。如果在中央暗区周围看到明亮的光环,则物镜的孔径太大,必须使用内部可变光阑减小,或者应选择数值孔径较小的物镜。调整光圈,直到光环掉出视场。如果观察到新月形的光弧,则聚光镜没有正确对准显微镜光轴的中心。

  • 更换目镜并聚焦样品,它现在应该在黑暗的背景上显得明亮而均匀。选择另一个物镜时,重复上述步骤以对齐聚光镜和物镜以优化暗场显微镜。

无论照明模式是明场、暗场、相衬还是其他一些对比度增强技术,都应始终仔细注意显微镜对准。在这项工作中花费的时间将以显微镜的出色性能得到回报,无论是常规观察还是关键的数字成像或显微摄影。

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