光学显微镜和显微成像对比

2022-07-27 14:32:51 admin 10

显微镜用来对标本的观察中,显微镜成像的实物和观察到的图像总会有一点失真的,尤其是显微镜成像系统观察,为了使标本看起来更为真实,下面我们来对比一下。

在光学显微镜中对标本进行成像时,强度和/或颜色的差异会产生图像对比度,从而使标本的各个特征和细节变得可见。对比度被定义为图像和相邻背景之间的光强度相对于整体背景强度的差异。通常,人眼需要 0.02(2%)的*小对比度值来区分图像与其背景之间的差异。对于其他检测器,例如胶片、摄像机或光电检测器(CCD 和 CMOS 设备),*小对比度通常是不同的值。对于每个检测器,信噪比(噪声是光学系统中没有图像信息的所有光)必须足够大,以便根据相干图像的形成进行解释。


通过光的吸收、亮度、反射率、双折射、光散射、衍射、荧光或颜色变化在样品中产生的对比一直是明场显微镜中对样品进行成像的经典手段。一个细节在背景或其他相邻细节中脱颖而出的能力是衡量样本对比度的一个指标。就一个简单的公式而言,对比度可以描述为

百分比对比度 (C) = ((I( s ) - I( b )) × 100)/I( b )

其中I( b )是背景强度,I( s )是样本强度。从这个方程可以看出,样本对比度是指图像中*高和*低强度之间的关系。图 1 中显示的图表说明了背景强度对对比度的影响。当背景是非常深的灰色时(I( b )等于 0.01),图像强度的微小变化会产生对比度的巨大变化。通过将背景调亮为稍微浅一些的灰色(I( b )等于 0.10),图像强度的微小变化提供了有用的对比度范围。在更浅的背景颜色(I( b ) > 0.20),图像对比度对背景强度相对不敏感,并且I( b ) 的大变化只会导致图像对比度的小幅增加或减少。

尽管现代显微镜中的光学系统可能能够在高倍率下产生高分辨率图像,但如果图像没有足够的对比度,这种能力就毫无价值。对比度不是样品的固有属性,而是取决于样品与光的相互作用以及光学系统的效率与其用检测器可靠地记录此图像信息的能力相结合的能力。显微镜光学系统中图像对比度的控制取决于几个因素,主要是孔径光阑的设置、光学系统中的像差程度、采用的光学对比度系统、样本类型和光学检测器。显微镜中有几个位置可以调整对比度。这些包括视场孔径、聚光镜孔径、

因为人眼通过图像中产生的对比度来感知物体,除非了解在图像中产生对比度的光学事件,否则很容易误入歧途。图 2 显示了相同视场的三张显微照片,其中包含透明、无色的人脸颊细胞,使用光学显微镜在不同对比度模式下成像:明场、相位对比度和霍夫曼调制对比度。很明显,这三个图像看起来不同,并且由于这些变化,显微镜师可能会从每个视场中得出不同的结论。图 2(a) 中所示的细胞是用在明场模式下运行的显微镜成像的,聚光镜光圈关闭到足以使样品边缘可见。


图 2(b) 显示了使用相差光学的脸颊细胞的相同视场。请注意围绕物体边缘的黑暗内部区域和明亮外部区域,例如细胞膜和细胞核(称为光晕,是伪影)。在此视图中,很难指定单元格的边缘并解释图像中暗区和亮区的原因。细胞也显得相当平坦。*后,图 2(c) 中所示的细胞是使用霍夫曼调制对比度成像的,其中图像的一侧是暗的而另一侧是亮的,从而导致对伪三维物体的感知。图 2 中的每个视场提供不同的标本图像并导致不同的解释,只能通过有关显微镜如何创建这些图像的知识来破译。

对于光学显微镜中的许多标本,尤其是未染色或活体材料,对比度非常差,以至于无论物镜分辨或清晰分离细节的能力如何,标本基本上都保持不可见。通常,对于此类标本,重要的是不要通过杀死或用化学染料或固定剂处理来改变它们。一百多年来,这种必要性促使显微镜专家尝试使用对比度增强技术,以期提高标本的可见性,并在不改变标本本身的情况下为图像带来更多细节。通常的做法是将聚光器孔径光阑减小到推荐尺寸以下或降低台下聚光器以增加样品对比度。不幸的是,虽然这些动作确实会增加对比度,

在讨论控制光学显微镜对比度的方法之前,考虑光和物质如何相互作用的特性是有用的。负责照亮标本的光可以是空间相干的、非相干的或部分相干的。例如,光束可以以狭缝或环形的形式成形,并且可以由在垂直于传播方向的所有方向或由于偏振而在单个方向上振动的选定波长组成。

一些标本被认为是振幅物体,因为它们部分或完全吸收光,因此可以使用传统的明场显微镜轻松观察。其他自然着色或人工染色的化学染料也可以用显微镜清晰成像。这些污渍或自然色会吸收一部分穿过的白光并透射或反射其他颜色。通常,将染色组合以产生对比色,例如用于细胞核的蓝色苏木精染色与用于细胞质的粉红色伊红组合。通常的做法是在不易吸收光线的标本上使用污渍,从而使此类图像对眼睛可见。

其他样品不吸收光,被称为相位物体由于人眼只能检测强度和颜色的差异,因此必须将物体引起的相位变化转换为强度差异。相位试样的特征有几个标准,包括它们的形状(通常是圆形或扁平)、内部光散射元素的密度、厚度和独特的化学或电结构特性(统称为折射率)。厚样品可能相对清晰,仅包含少数光散射元素,或者它们可能包含许多不透光的散射元素,并使样品对透射照明有效不透明。这些标本通常被称为反射光标本。

在考虑增强样本对比度的光学方法时,考虑样本的各种特性是有用的,这些特性可以被操纵以创建这些特性的强度变化,从而使它们可见。一个主要的问题是,在一组独特的环境下,物体的哪些特征会被转换成不同的强度。

如果样品与其周围介质(周围环境)之间的折射率存在差异,那么尺寸接近成像光波长的样品细节和边缘会衍射或散射光。 折射率定义为光通过空气或真空的速度除以光通过物体的速度的比值。因为通过任何材料的光速都小于真空中的光速,所以用显微镜检查的样品的折射率总是超过 1.0 的值。为了解决物体之间的小距离并以合理的保真度再现其形状,显微镜物镜必须捕获大角度的衍射光。

图 2(b) 显示了使用相差光学的脸颊细胞的相同视场。请注意围绕物体边缘的黑暗内部区域和明亮外部区域,例如细胞膜和细胞核(称为光晕,是伪影)。在此视图中,很难指定单元格的边缘并解释图像中暗区和亮区的原因。细胞也显得相当平坦。*后,图 2(c) 中所示的细胞是使用霍夫曼调制对比度成像的,其中图像的一侧是暗的而另一侧是亮的,从而导致对伪三维物体的感知。图 2 中的每个视场提供不同的标本图像并导致不同的解释,只能通过有关显微镜如何创建这些图像的知识来破译。

对于光学显微镜中的许多标本,尤其是未染色或活体材料,对比度非常差,以至于无论物镜分辨或清晰分离细节的能力如何,标本基本上都保持不可见。通常,对于此类标本,重要的是不要通过杀死或用化学染料或固定剂处理来改变它们。一百多年来,这种必要性促使显微镜专家尝试使用对比度增强技术,以期提高标本的可见性,并在不改变标本本身的情况下为图像带来更多细节。通常的做法是将聚光器孔径光阑减小到推荐尺寸以下或降低台下聚光器以增加样品对比度。不幸的是,虽然这些动作确实会增加对比度,

在讨论控制光学显微镜对比度的方法之前,考虑光和物质如何相互作用的特性是有用的。负责照亮标本的光可以是空间相干的、非相干的或部分相干的。例如,光束可以以狭缝或环形的形式成形,并且可以由在垂直于传播方向的所有方向或由于偏振而在单个方向上振动的选定波长组成。

一些标本被认为是振幅物体,因为它们部分或完全吸收光,因此可以使用传统的明场显微镜轻松观察。其他自然着色或人工染色的化学染料也可以用显微镜清晰成像。这些污渍或自然色会吸收一部分穿过的白光并透射或反射其他颜色。通常,将染色组合以产生对比色,例如用于细胞核的蓝色苏木精染色与用于细胞质的粉红色伊红组合。通常的做法是在不易吸收光线的标本上使用污渍,从而使此类图像对眼睛可见。

其他样品不吸收光,被称为相位物体由于人眼只能检测强度和颜色的差异,因此必须将物体引起的相位变化转换为强度差异。相位试样的特征有几个标准,包括它们的形状(通常是圆形或扁平)、内部光散射元素的密度、厚度和独特的化学或电结构特性(统称为折射率)。厚样品可能相对清晰,仅包含少数光散射元素,或者它们可能包含许多不透光的散射元素,并使样品对透射照明有效不透明。这些标本通常被称为反射光标本。

在考虑增强样本对比度的光学方法时,考虑样本的各种特性是有用的,这些特性可以被操纵以创建这些特性的强度变化,从而使它们可见。一个主要的问题是,在一组独特的环境下,物体的哪些特征会被转换成不同的强度。

如果样品与其周围介质(周围环境)之间的折射率存在差异,那么尺寸接近成像光波长的样品细节和边缘会衍射或散射光。 折射率定义为光通过空气或真空的速度除以光通过物体的速度的比值。因为通过任何材料的光速都小于真空中的光速,所以用显微镜检查的样品的折射率总是超过 1.0 的值。为了解决物体之间的小距离并以合理的保真度再现其形状,显微镜物镜必须捕获大角度的衍射光。

由物镜收集的衍射(或偏离)光必须在图像平面上形成清晰的焦点,以生成样品细节,如图 3 所示。在图像平面上,包含衍射光的光波与未衍射光发生干涉干涉后光的可见性在很大程度上取决于照亮样品的光的相干性,可见性通过增加相干性成比例地增加。在光学显微镜中,聚光镜孔径光阑开口尺寸控制着照射在样品上的光的空间相干性。减小隔膜开口尺寸会产生更大的空间相干性。


显微镜学家长期以来一直依靠减小聚光镜孔径光阑开口尺寸来提高相位样品中颗粒和边缘的可见性。通过适当调整聚光镜孔径也可以改善振幅物体的对比度。小物体、边缘和粒子会衍射光,无论它们是属于振幅样本还是相位样本。由于物镜的数值孔径限制,只有一部分衍射光被物镜捕获(见图 3)。未被收集的剩余衍射光代表丢失的图像信息。聚光镜孔径光阑开口尺寸的正确设置是增强标本图像对比度和引入衍射伪影之间的权衡。这些表现在分辨率的丧失,衍射环的叠加,以及源自样品中非共同焦点区域的其他不良光学效应。随着接近衍射极限,随着物体细节变小和空间频率变大,图像对比度变低。

Inoué 和 Spring将图像对比度与样本对比度的比率以及实际和理想化正弦图像所占据位置的相移描述为光学传递函数 (OTF),当绘制为空间频率的函数时。在来自样品的光分布变为正弦曲线的情况下,光学传递函数的模量变为调制传递函数 (MTF)。随着空间频率的增加,调制传递函数降低,样本对比度降低。

对于每个物镜,特定的调制传递函数取决于物镜设计和数值孔径、对比度生成模式、照明光波长和台下聚光器的数值孔径。物镜后焦平面的边缘充当衍射光的低通滤波器,衍射光必须聚焦在图像平面上才能发生干涉并形成粒子或边缘的图像。聚焦显微镜将这些衍射光波聚集在中间图像平面上。光波前相对于样品的角度决定了聚焦在光滑圆形表面的顶部或底部的难度,这些表面通常不包含衍射点。然而,

在讨论相位样本时,我们将对象定义为样本的任何可解析部分。许多物体将是平坦的或板状的,如图 4 所示。在该图中,物体具有厚度 ( t ) 和折射率n( s )周围介质的折射率为n( m )


通过与光路,试样光行进OP = T(N(小号)) 并通过与一个光路中,周围介质OP = T(N()) 光程差(OPD)可以表示为

OPD = (tn( s ) - tn( m )) = t(n( s ) - n( m ))

相位差为

δ = (2π / λ) (OPD)

其中π是一个常数 (3.14159265),λ是照射样品的光的波长。光程差是两项的乘积:厚度 ( t ) 和折射率差 ( n )。即使物体的厚度很薄,OPD 也常常很大。另一方面,当样品和周围介质的折射率相等时,即使样品厚度非常大,OPD 也为零。在这种情况下,穿过物体的光仅相对于穿过相等厚度的环绕物的光延迟(相位差)。人眼无法检测到相位差。

光程差

检查样品厚度和折射率的变化如何影响样品与其周围环境之间的光程差。


相差显微镜被设计为采取的试样中,并在周围介质中的对象之间的相位差的优势。然而,这不仅仅是必要的相位差,还必须发生来自样品的衍射,相差显微镜才能工作。

相位物体*常见的形状是连续变化的光路或密度之一,如图 5 所示的半球形样品。在这种情况下,相位物体的侧面可以通过棱镜形状在数学上近似,如下所述. 图 5 中相位物体的折射率指定为n( s ),而周围介质的折射率指定n( m )相位对象形状的根本几何转变仅发生在边缘AB(见图 5(a))。入射光垂直于平面AB撞击物体,而平面波前平行于AB

1处的边界(图 5(a) 中圆形相位对象的顶点)基本上平行于入射波前,而AB处的边界是垂直的。区域24是微型棱镜,由相位对象的圆形表面的切线定义(图 5(b))。的“棱镜”角度是较小的区域2比在区域4,这是相反的区域4'在边缘AB衍射*强。

因此,弯曲的物体由许多棱柱组成,物体的相对两侧具有朝向相反方向的棱柱。*陡峭的棱镜位于球体的赤道,而斜率*小的棱镜位于顶部和底部。这些微型棱镜形成光学梯度

OG (光学梯度) = Φ = α (n ( s ) - n ( m ))

其中α是切线相对于平面波前的角度。请注意,光学梯度是两项的乘积:光通过的两侧之间的角度 ( α ) 和折射率差 ( n( s ) - n( m ) )。穿过棱镜的光改变方向的角度为Φ(见图5(c)和5(d))。如果折射率差异很大,即使斜率或边界梯度可能很小,方向的变化也可能很大。如果折射率相同,则光波通过相位物体而不会发生折射。光离开棱镜的方向取决于相位物体 ( n( s ) ) 与其周围介质 ( n( m );见图 5(c) 和 5(d))之间折射率的相对差异

相位对象中的光学梯度

了解相位物体形状和折射率的变化如何影响光通过的过程

正如我们上面所讨论的,圆形相位物体具有不断变化的光学梯度,每个单独的光学梯度“棱镜”都会产生不同的光偏转角度。图 5(c) 说明了当周围介质的折射率大于相位物体 ( n( m ) > n( s ) )时的偏转方向,而图 5(d) 显示了相反时的方向 ( n( m ) < n( s ) )。偏转角Φ与切线角 ( α ) 和折射率差 ( n( s ) - n( m ) )成正比,因此

tan Φ = tan α (n ( s ) - n ( m ))

对于小角度

Φ = α (n( s ) - n( m ))(以弧度为单位)

总结光学梯度边界的“棱镜”效应,当相位物体的折射率超过周围介质的折射率时,物体的每个斜面上大小相等的梯度以相同的角度偏转。该偏转角取决于相对折射率差和几何切线角 ( α )。当介质的折射率 ( n( m ) ) 大于物体的折射率 ( n( s ) ) 时,偏转与情况相反时相反。当没有梯度时,通过的光没有偏转。

光可以通过各种机制与样本相互作用以产生图像对比度。这些包括来自表面的反射、吸收、折射、偏振、荧光和衍射。对比度也可以通过显微镜光学组件和照明模式的物理修改以及通过摄影或数字电子技术处理*终图像来增加。以下讨论重点介绍了样品与光之间的各种相互作用,并回顾了一些已开发用于增强样品对比度的光学显微镜技术。

当入射光照射到不透明表面时,它会以特定于该表面地形的方式反射。非常光滑的表面以与入射光相同的角度反射光,这种机制称为镜面反射不平坦或漫反射的表面倾向于通过称为漫反射的现象以所有可能的角度反射光,导致进入物镜的光量减少。仔细准备样品可以增强反射光显微镜中的对比度。金相样品通常用反应性液体和气体蚀刻以显示晶界和/或抛光以增加反射到显微镜中的光量。荧光染料、薄膜和金属涂层形式的污渍也用于在反射光显微镜标本中引入对比度。双折射样品可以使用偏振反射光成像,透明相位物体通常是使用反射微分干涉对比、暗场照明和霍夫曼调制对比等技术进行观察的对象。

人眼对样本中的振幅和波长差异非常敏感。出于这个原因,许多标本被切成非常薄的部分(厚度为 1-30 微米)并用化学染料染色,以增加对比度并区分标本内的结构。数百年来,这种技术已非常普遍地用于生物标本。染料选择性地吸收一种或几种波长的光,并通过或反射所有其他波长。一个例子是蓝色染料,它吸收所有可见光波长,但蓝色除外,蓝色从样品反射并透过样品。生物标本的内部结构元素通常用染料混合物染色,以选择性地染色这些元素,

这些技术也适用于荧光染料,可用于增加具有高度特异性的标本的对比度。当荧光样品受到一种波长的可见光或近紫外光的刺激时,它们通常会发出更长波长的光,从而变得可见或与现场或背景中的其他物体形成对比(图 6)。荧光显微镜技术在显微镜入门的另一部分详细讨论。


一种早期和目前使用的增加染色标本对比度的方法是在光路中使用彩色对比滤光片、Wratten 漆明胶方块(来自柯达)或干涉滤光片。例如,如果样品被红色染色,绿色滤光片会使红色区域变暗,从而增加对比度。另一方面,绿色滤镜会使任何绿色染色区域变亮。彩色滤光片是非常有价值的样本对比度辅助工具,特别是当黑白显微摄影是目标时。绿色滤光片对于消色差物镜(针对绿光进行球面校正)和相衬物镜(其设计用于假设使用绿光来操纵波长)特别有价值,因为相位样品通常是透明的且缺乏固有颜色。

各向异性材料通常表现出两个或多个折射率,因此被称为双折射或双折射。属于这一类的标本包括矿物、晶体(具有高度的结构对称性)、纤维、毛发和其他生物标本。当光进入各向异性晶体的非光轴(光轴以外的轴)时,它被折射成两条光线,每条光线都偏振,其振动方向彼此成直角,并以不同的速度传播。由此产生的光波是偏振的,当在显微镜分析仪中重新组合时会产生干扰,以产生高度着色并包含大量对比度的双折射样品的图像。

在明场照明下观察时通常会产生较差图像的活标本和其他相位物体在相位对比、霍夫曼调制对比度和微分干涉对比照明下观察时通过光学而不是化学方法变得清晰可见。这些技术需要显微镜中的特殊光学组件,但通常会产生足够对比度的图像,以揭示有关样品结构的重要细节。有关这些对比度增强技术的更深入讨论,请参见我们的专业显微镜技术部分。

另一种提高对比度的简单技术包括选择一种折射率与样品的折射率大不相同的封固剂。例如,硅藻可以安装在各种对比度增强介质中,例如空气或商业介质 Styrax。折射率的差异提高了这些无色物体的对比度,并使它们的轮廓和标记更加明显。以下部分描述了当今显微镜学家用来提高标本对比度的许多更复杂的技术。

对比增强技术
标本
类型
成像
技术
透射光
透明标本
相对象

细菌、精子、
玻璃容器中的细胞、
原生动物、螨虫、纤维等。
相位对比
微分干涉对比 (DIC)
霍夫曼调制对比
斜照明
光散射物体
硅藻、纤维、毛发、
淡水微生物、
放射虫等。
Rheinberg Illumination
暗场照明相差
和 DIC
光折射样品
胶体悬浮液
粉末和矿物质
液体
相衬
色散染色
DIC
振幅样本
染色组织
自然色样本
毛发和纤维
昆虫和海藻
明场照明

组织培养中的荧光标本细胞荧光
染料染色切片
涂片和涂抹
荧光照明
双折射样品
矿物薄片
液晶
熔化和重结晶 化学品
毛发和纤维
骨骼和羽毛
偏光照明
反射光
镜面(反射)表面
薄膜、镜面
抛光冶金样品
集成电路
明场照明相衬
,DIC
暗场照明
漫射(非反射)表面
薄膜和厚膜
岩石和矿物
毛发、纤维和骨
昆虫
明场照明相衬
,DIC
暗场照明
振幅表面特征
染色纤维
漫射金属样品
复合材料
聚合物
明场照明
暗场照明
双折射样品
矿物薄片
毛发和纤维
骨骼和羽毛
单晶
取向膜
偏光照明
荧光标本 固定
细胞荧光
染色切片
涂片和涂片
荧光照明
表 1

表 1 总结了使用透射和反射光显微镜研究的各种标本和材料的对比度增强技术。此表可用作解决光学显微镜中特定成像问题的粗略指南。奥林巴斯显微镜资源中心显微镜入门的专业技术部分提供了有关对比度增强的其他材料